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胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建和mre操纵子的结构与功能分析

2020-12-03阅读(315)

胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建和mre操纵子的结构与功能分析

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成了严重的经济损失。APP至少可分为15种血清型,各血清型菌株的毒力和免疫原性差异较大,缺乏有效的免疫保护力,而且各地区流行的优势血清型不尽相同,这给APP的诊断和防治带来了极大的困难。APP分子致病机理的解析是设计和开发新的防治技术与产品的基础。本论文从APP基因组中鉴定了一个mreBCD操纵子,可能是一个潜在的新型抗菌药物的靶标。同时,运用信号标签突变（signature-tagged mutagenesis,STM）技术,构建了4个STM突变体库,共216个突变体,为APP新的毒力相关基因的发掘奠定了基础。1.胸膜肺炎放线杆菌mre操纵子的结构分析mre操纵子是存在于杆状细菌中,调节杆状细胞形态的重要决定操纵子。操纵子中mreB基因编码的产物MreB的氨基酸序列、装配方式、结构与功能以及三级结构方面与真核生物中肌动蛋白丝均具有较高的类似性,MreB被认为是肌动蛋白丝的原核类似蛋白,除了参与细菌细胞的形态形成与维持,还是某些细菌存活及染色体复制后的分离所必需的。本试验通过生物信息学技术从APP基因组contigs中鉴定了APP的mre操纵子,发现它与多数细菌相应操纵子结构类似,均由B、C和D三个基因组成。对APP血清1、3、5型mre操纵子进行了克隆和序列分析,同源性分析结果显示,在APP 3种血清型中,mre操纵子的DNA序列和氨基酸序列同源性几乎完全相同;而将APP血清1型mre操纵子序列与Escherichia coli,Haemophilus ducreyi基因序列对比,同源性分别达到79%和82%,说明了mre操纵子在杆状细菌中序列十分保守。2.胸膜肺炎放线杆菌mre操纵子的功能分析根据APP血清1型的mre操纵子序列,用PCR分别克隆了mreB基因和mreCD基因的编码区以及编码MreB氨基端66个氨基酸的基因片段,分别置于阿拉伯糖诱导型启动子下游,构建了一系列自杀性重组质粒,电转化APP血清1型菌株,筛选获得一系列单交换突变株,分别在有和无阿拉伯糖存在的培养基中培养,观察突变株的生长特性和形态变化。结果表明了mreB和mreCD基因的缺失均导致APP菌体变圆和变小,而过量表达则导致菌体变长和变粗;无论是缺失还是过量表达均显著抑制APP的生长和降低其存活能力;mreB基因对上述表型的影响比mreCD基因显著。可见,mre操纵子是APP维持其短杆状形态和正常生长的所必需的,是潜在的抗菌药物靶标。3.STM突变体库的构建STM是一种高通量的负向筛选突变基因的方法,其基本原理是将不同序列的寡聚核苷酸（tag）,插入到细菌基因组的不同位置,造成基因表达失活,以致突变体侵入宿主后无法生存,用体外培养和从体内分离得到细菌DNA为模板制备tag探针分别与原突变体库中的细菌基因组杂交,两者对比,那些无杂交信号的突变体所对应的突变基因就是细菌在宿主体内生存的必需基因。本实验通过对mating方法的摸索,确立了比较成熟的双亲本mating方法的条件,完成了48个STM转座子标签中的4个标签（Tag 7、Tag 8、Tag 11和Tag 12）的突变体库的构建,得到了216个突变体。目前,这项工作仍在进行,为发掘新的功能基因的奠定了基础。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表（Abbreviation）
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 猪传染性胸膜肺炎的概述
  • 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎的病原学
  • 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的流行病学
  • 1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的危害
  • 1.1.4 猪传染性胸膜肺炎的检测和诊断
  • 1.1.5 猪传染性胸膜肺炎的防制
  • 1.2 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究进展
  • 1.2.1 外毒素
  • 1.2.2 荚膜多糖
  • 1.2.3 脂多糖
  • 1.2.4 外膜蛋白
  • 1.2.5 转铁结合蛋白
  • 1.3 原核细胞骨架蛋白的结构和功能概述
  • 1.3.1 原核细胞骨架蛋白的结构与功能
  • 1.3.2 mre操纵子研究进展
  • 1.4 信号标签突变（STM）技术
  • 1.4.1 STM技术的原理
  • 1.4.2 STM技术的应用
  • 第2章 胸膜肺炎放线杆菌mre操纵子的结构分析
  • 2.1 研究目的及意义
  • 2.2 实验材料
  • 2.2.1 菌株
  • 2.2.2 寡核甘酸引物
  • 2.2.3 培养基
  • 2.2.4 主要试剂
  • 2.3 实验方法
  • 2.3.1 细菌的增殖
  • 2.3.2 细菌PCR模板制备
  • 2.3.3 PCR扩增
  • 2.3.4 mre操纵子结构分析
  • 2.4 结果与分析
  • 2.4.1 mre操纵子结构分析及比较
  • 2.4.2 mre操纵子完整性的验证
  • 2.5 结论及讨论
  • 第3章 胸膜肺炎放线杆菌血清1型4074株mre操纵子突变体构建
  • 3.1 目的及意义
  • 3.2 实验材料
  • 3.2.1 菌株和质粒
  • 3.2.2 寡核甘酸引物
  • 3.2.3 培养基
  • 3.2.4 主要试剂
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 细菌的增殖
  • 3.3.2 细菌PCR模板制备
  • 3.3.3 PCR扩增
  • 3.3.4 限制性酶切
  • 3.3.5 从凝胶中回收目的片段
  • 3.3.6 DNA片断的连接
  • 3.3.7 感受态的制备及转化
  • 3.3.8 碱裂解法小量制备质粒DNA
  • 3.3.9 APP4074电转感受态细胞的制备及电转化
  • 3.3.10 重组质粒的构建
  • 3.3.11 重组质粒的鉴定
  • 3.3.12 突变菌株的筛选和鉴定
  • 3.3.13 细菌RNA提取
  • 3.3.14 反转录PCR
  • 3.3.15 突变菌株荧光定量PCR检测
  • 3.3.16 细菌生长特性检测
  • 3.3.17 细菌表型特征检测
  • 3.4 结果与分析
  • 3.4.1 重组质粒鉴定
  • 3.4.2 mre操纵子突变体的构建及鉴定
  • 3.4.3 所获得的mre操纵子系列突变株
  • 3.4.4 mre操纵子系列突变株对APP4074生长的影响
  • 3.4.5 mre操纵子系列突变株对APP4074细胞形态的影响
  • 3.4.6 荧光定量检测基因表达
  • 3.5 结论及讨论
  • 第4章 胸膜肺炎放线杆菌STM突变体库的构建
  • 4.1 目的及意义
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 菌株与质粒
  • 4.2.2 培养基和抗生素的配置
  • 4.2.3 寡聚核甘酸引物
  • 4.2.4 酶和试剂
  • 4.2.5 特异性标签
  • 4.2.6 其他试剂
  • 4.3 实验方法
  • 4.3.1 细菌的培养和抗性诱导
  • 4.3.2 质粒pLOF/Km tag1-48的增殖与保存
  • 4.3.3 细菌结合实验及抗性筛选
  • 4.3.4 突变体的PCR鉴定
  • 4.3.5 突变体的Southern Blot分析
  • 4.3.6 突变体的冻干保存
  • 4.4 结果与分析
  • 4.4.1 两亲本结合和三亲本结合方法的比较
  • 4.4.2 不同APP菌株结合转座效率比较
  • 4.4.3 突变体获取及鉴定
  • 4.4.4 突变体库的构建
  • 4.5 讨论
  • 4.5.1 关于萘啶酸抗性菌株的获得
  • 4.5.2 关于结合转移试验方法
  • 4.5.3 关于突变体的构建
  • 小结
  • 参考文献
  • 致谢

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