血清高密度脂蛋白1对人单核源性巨噬细胞泡沫化的影响

论文摘要

研究背景已证实血清高密度脂蛋白（HDL）具有抗动脉粥样硬化（AS）及心脏保护的作用。HDL由多种具有不同颗粒特性与生理功能的亚类组成,不同亚类在HDL抗AS的总体效应中发挥不同的作用,对防治冠心病（CHD）有重要意义。但是,目前国内外对HDL亚类的组成和颗粒特性仍不甚清楚,临床还不能通过HDL亚类调节RCT而获得明显的治疗效果。由于HDL组成具有复杂的不均一性,同时由于其颗粒结构特殊,因而如何通过检测HDL亚类来分析胆固醇逆向转运（RCT）的状态,以及对HDL亚类尤其是其新类型的理化结构和生理功能进行深入探讨,是目前研究的热点与难点。在我们的前期研究中,通过分段浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳（sd-PAGE）的新方法,将SBB预染血清同步分离出11～13条区带,分别为2种游离脂肪酸(ALB-FFA1-2)、5种HDL亚组分(HDL1-5)、3种表现型的低密度脂蛋白（LDL）、中间密度脂蛋白（IDL）、2种极低密度脂蛋白（VLDL）,以及滞留于原点的乳糜微粒（CM）。Sd-PAGE新方法不仅能将血清CM、VLDL、IDL、LDL及HDL等区分开来,而且可以对各组分作进一步的亚类分离,尤其突出的是HDL的5种亚类及其新类型（包括HDL5）。在前期研究中,我们发现HDL1在所有sd-PAGE实验的分离凝胶中均呈孤立分带,表明它是一种相对独立的新组分。这是一种新现象,对其进行深入研究具有重要的学术价值和临床意义。目的本实验旨在采用sd-PAGE新方法从血清中分离与制取HDL的特殊亚类HDL1,从细胞水平观察其对人外周血单核源性巨噬细胞泡沫化的影响,探讨其在HDL抗动脉粥样硬化中所发挥的作用,进而为从分子水平及受体水平对其进行深入研究提供线索。方法1、低密度脂蛋白（LDL）的制备与氧化修饰:采用一次性密度梯度超速离心法从血浆中分离LDL,采用琼脂糖凝胶电泳对其进行鉴定,改良Lowry法进行蛋白定量。以Cu2+诱导法对其进行氧化修饰,硫代巴比妥酸值（TBARS）法测定其氧化程度。2、血清HDL1的分离和制备:首先用苏丹黑B（SBB）将血清进行预染,采用分段浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳（sd-PAGE）新方法同步分离血清LDL、HDL及其亚类等各种脂蛋白成分,采用自制洗脱、浓缩装置定量制备血清HDL1。采用改良Lowry法对其进行蛋白定量,生化酶法和比浊法检测HDL1溶液中apoA-I的含量。3、人外周血单核细胞的制备:采用密度梯度离心法和塑料吸附法从受试者外周血中分离出单核细胞。以台盼兰拒染法和流式细胞技术检测分离细胞的存活率与细胞纯度。4、泡沫细胞模型的建立4.1单核细胞转化为巨噬细胞:单核细胞以50 nmol/L佛波酯（PMA）诱导48 h,使之转化为巨噬细胞。光镜下进行形态学观察。4.2巨噬细胞转化为泡沫细胞:将巨噬细胞与80 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）共孵育24 h,使之转化为泡沫细胞。采用油红O染色后光镜观察、透射电镜观察,以及测定细胞内胆固醇含量和蛋白含量等方法对细胞模型进行形态学观察与生物学鉴定。4.3细胞存活率检测:采用台盼兰拒染法测定实验各阶段中的细胞活性与细胞存活率,观察不同浓度的HDL1,以及同一浓度的HDL1作用不同时间后对培养细胞是否存在毒性等不良作用。5、细胞内胆固醇及蛋白含量的测定:采用胆固醇酯测定酶法测定细胞内胆固醇含量,即分别采用总胆固醇（TC）与游离胆固醇（FC）含量酶法测定试剂盒测定细胞内胆固醇含量,以TC减去FC代表胆固醇酯（CE）的含量;采用改良Lowry法测定细胞内蛋白质（Pro）的含量,最后计算细胞内CE/TC比值及TC/Pro比值。6、HDL1对巨噬细胞内胆固醇和蛋白质含量的影响:实验细胞分为对照组与实验组,其中对照组分别设空白对照（RPMI-1640组）、阳性对照（ox-LDL组）以及标准对照（apoA-I+ox-LDL组）三组,实验组细胞首先以80 mg/L ox-LDL+不同浓度（0.1、1.0、10.0 mg/L）的HDL1干预24 h,采用胆固醇酯测定酶法测定细胞内总胆固醇（TC）、游离胆固醇（FC）及胆固醇酯（CE）等指标,确定HDL1降低细胞内TC/Pro比值的最佳浓度,作出量效关系曲线;以HDL1的最佳浓度预处理巨噬细胞1 h后,加入80 mg/L ox-LDL共孵育不同时间,即0、6、12、24 h。检测相关指标,确定HDL1降低细胞内TC/Pro比值的最佳时间,作出时效关系曲线。7、统计学处理:实验结果均采用Mean±SD表示,组间差异进行单因素方差分析（ONE WAY ANOVA）后,再用LSD检验;方差不齐者采用非参数秩和检验。用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析,以α=0.05为检验水准。结果1、血清脂蛋白的分离效果:通过sd-PAGE新方法将SBB预染血清同步分离出13条区带,分别为2种游离脂肪酸(AL-FFA1-2)、5种HDL亚组分(HDL1-5,其中HDL1与HDL5为其新类型)、3种表现型的低密度脂蛋白（LDL）、中间密度脂蛋白（IDL）、2种极低密度脂蛋白（VLDL）,以及滞留于原点的乳糜微粒（CM）。2、细胞模型的建立2.1单核细胞转化为巨噬细胞:经50 nmol/L PMA诱导48 h后光镜下观察大部分单核细胞已由圆形变成多角形状,并易于聚集、贴壁,说明单核细胞已分化成为形态典型的巨噬细胞。2.2巨噬细胞转化为泡沫细胞:巨噬细胞与80 mg/L ox-LDL共孵育24 h后,油红O染色后光镜观察及透射电镜观测发现细胞内存在大量的红染脂质颗粒与较多的脂质空泡,胆固醇含量测定发现细胞内CE/TC＞60%,符合泡沫细胞的生物学定义。3、HDL1对巨噬细胞泡沫化的影响:经不同浓度HDL1作用后,巨噬细胞内TC/Pro比值随HDL1浓度的增加而呈剂量依赖性降低（P＜0.01）,巨噬细胞的泡沫化程度（CE/TC比值）也随着HDL1浓度的升高而降低,且在浓度一定的情况下,细胞内TC/Pro比值随HDL1处理时间的延长而呈时间依赖性降低（P＜0.01）,与空白、阳性对照组相比,均有显著性差异（P＜0.05）。结论1、Sd-PAGE电泳新方法不仅能将CM、VLDL、IDL、LDL及HDL等血清脂蛋白成分在分离凝胶中清晰地区分开来,而且可以对各组分作进一步的亚类分离,尤其突出的是HDL的5种亚类（其中HDL1、HDL5等为其新类型）。与既往分离血清脂蛋白亚组分的众多方法相比,该法具有明显的性能优势。2、在巨噬细胞泡沫化过程中,HDL1的干预与细胞内TC/Pro比值存在较明显的量效与时效关系,表明HDL1通过降低细胞内TC的含量,使细胞内TC/Pro比值及CE/TC比值降低,一定程度上减轻了巨噬细胞的泡沫化程度。本实验初步证实了HDL1具有抑制巨噬细胞泡沫化的功能,因而在HDL抗动脉粥样硬化过程中发挥一定的作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 一 实验材料
• 二 实验方法
• （一） LDL的制备与氧化修饰
• 1的分离和制备'>（二） 血清HDL₁的分离和制备
• （三） 单核细胞的分离
• （四） 泡沫细胞模型的建立
• （五） 细胞存活率检测
• （六） 胆固醇酯测定酶法测定细胞内胆固醇含量
• 1对巨噬细胞内胆固醇与蛋白质含量的影响'>（七） HDL₁对巨噬细胞内胆固醇与蛋白质含量的影响
• （八） 统计学处理
• 结果
• 一 血浆脂蛋白的分离与鉴定结果
• 二 LDL氧化程度的测定结果
• 三 单个核细胞的分离结果
• 1的分离效果'>四 血清HDL₁的分离效果
• 五 细胞模型的建立
• 1干预后细胞内胆固醇与蛋白质含量的改变'>六 不同浓度的HDL₁干预后细胞内胆固醇与蛋白质含量的改变
• 1处理不同时间后细胞内胆固醇与蛋白质含量的改变'>七 HDL₁处理不同时间后细胞内胆固醇与蛋白质含量的改变
• 讨论
• 一 血浆脂蛋白的分离与鉴定
• 二 单个核细胞的分离
• 1的分离效果'>三 血清HDL₁的分离效果
• 四 细胞模型的建立
• 1对人单核源性巨噬细胞泡沫化的影响'>五 血清HDL₁对人单核源性巨噬细胞泡沫化的影响
• 结论
• 参考文献
• 附录（英文缩略词表）
• 读硕期间发表论文情况
• 文献综述
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审核证明