水稻β-石竹烯和柠檬烯基因的克隆鉴定、原核表达及其遗传转化

论文摘要

先期研究结果表明,茉莉酸甲酯（MeJA）和茉莉酸（JA）处理以及二化螟（Chilo suppressalia（Walker））为害能增加水稻挥发性萜类化合物β-石竹烯和柠檬烯的释放量,并且利用反向遗传学方法证明了β-石竹烯能对稻飞虱卵期重要寄生蜂,稻虱缨小蜂Anagrus nilaparvata Pang et Wang产生明显的引诱作用。然而,在水稻整体的直接与间接的诱导防御反应中,这两种挥发性萜类化合物究竟起着什么作用,至今尚不清楚。为此,本文克隆了水稻β-石竹烯合成酶（OsCAS）基因和柠檬烯合成酶（OsLIMS）基因的全长序列,并就两个目的基因的原核表达、过量表达与RNAi突变体品系的建立以及OsCAS基因的诱导表达特征进行了研究,为全面剖析β-石竹烯和柠檬烯在水稻抗虫反应中的作用打下基础。主要结果如下:1、根据已报道的水稻OsCAS基因（AK241679）)的序列设计引物,克隆了OsCAS基因全长序列。水稻OsCAS与其它植物已知的β-石竹烯合成酶的系统进化树分析表明,水稻OsCAS基因与同为单子叶玉米的β-石竹烯合成酶基因同源性达99%,而与其它植物的β-石竹烯合成酶基因同源性仅为51%。通过诱导表达特征分析表明,水稻OsCAS基因在褐飞虱为害后1h和12h、JA处理后1h和24 h表达水平明显上调,但H2O2处理不表达。本文构建了OsCAS基因的原核表达载体pET32a（+）-OsCAS,并在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了表达,通过SDS-PAGE分析结果显示,目的基因在IPTG诱导后3h、4h和5h获得了表达。通过农杆菌转化系统,获得了含有OsCAS基因过量表达或RNAi的T0代转基因水稻品系,为进一步研究OsCAS基因在水稻诱导防御反应中的作用打下了基础。2、根据已报道的水稻OsLIMS基因（NM0010483019）的序列设计引物,克隆了OsLIMS基因的全长序列。水稻OSLIMS与已知植物的柠檬烯合成酶的系统进化树分析表明,水稻OsLIMS与其它植物的柠檬烯合成酶基因同源性仅有41%,明显低于其它植物之间该基因的同源性（45%-99%）。本文构建了OsLIMS基因的原核表达载体pET32a（+）-OsLIMS,并在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了表达,通过SDS-PAGE分析结果显示,目的基因在IPTG诱导后4h、5h、6h、7h和8h获得了表达。通过农杆菌转化系统,获得了含有OsLIMS基因过量表达或RNAi的T0代转基因水稻品系,为进一步研究OsLIMS基因在水稻诱导防御反应中的作用打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述及研究目的与意义
• 1、植物萜类化合物生物合成的特点
• 2、萜类化合物的生物合成途径
• 2.1 细胞质中的MVA 途径
• 2.2 质体中的DXP 途径
• 3、单萜和倍半萜合成酶
• 4、萜类化合物合成的调控
• 4.1 植物萜类合成酶相关基因的空间差异表达
• 4.2 植物萜类合成酶相关基因的时间差异表达
• 4.3 植物萜类合成酶相关基因的受环境因子胁迫影响的表达
• 5、柠檬烯和Β-石竹烯合成酶及其主要产物的生物学功能
• 6、本文的研究目的与意义
• 第二章 水稻OSCAS 基因克隆鉴定、原核表达及其遗传转化
• 1、材料与方法
• 1.1 水稻品种和虫源
• 1.2 菌株、酶、载体及试剂
• 1.3 水稻处理
• 1.4 水稻OsCAS 基因克隆及鉴定
• 1.4.1 水稻总RNA 的提取
• 1.4.2 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳
• 1.4.3 水稻cDNA 第一链合成
• 1.4.4 目的片段cDNA 的扩增及PCR 产物的纯化
• 1)目的片段的扩增
• 2)PCR 产物的纯化
• 1.4.5 目的片段与T 载体的连接、转化与测序
• 1)连接
• 2)大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3)重组质粒大肠杆菌转化
• 4)重组质粒提取、酶切鉴定及目的片段测序
• 1.5 水稻OsCAS 基因的原核表达
• 1.5.1 融合表达载体pET32a（+）-OsCAS 的构建
• 1)目的基因ORF 的扩增、鉴定与PCR 的产物纯化
• 2)pET32a（+）质粒的提取
• 3)目的片段与表达载体pET32a（+）的连接
• 4)融合表达载体的转化与鉴定
• 1.5.2 融合蛋白的诱导表达
• 1.5.3 融合蛋白的SDS—PAGE 检测
• 1)分离胶和浓缩胶的的制备
• 2)SDS-PAGE 检测
• 1.6 水稻OsCAS 基因的诱导表达特征分析
• 1.7 Northern 杂交
• 1.7.1 Northern 转膜
• 1.7.2 预杂交
• 1.7.3 杂交
• 1.7.4 洗膜
• 1.7.5 显影
• 1.8 农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生
• 1.8.1 过量表达载体和RNAi 载体的构建
• 1)目的片段的扩增、鉴定及PCR 产物纯化
• 2)目的片段与PCAMBIA1301 载体、pMECE 载体的连接及转化
• 3)重组质粒pCAMBIA1301-OsCAS 和pMECE-OsCASRL 的酶切与鉴定
• 1.8.2 重组质粒pCAMBIA1301-OsCAS 和pMECE-OsCASRL 农杆菌的转化
• 1)农杆菌感受态细胞的制备
• 2)重组质粒农杆菌转化
• 1.8.3 农杆菌介导的遗传转化
• 1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导
• 2)用于转化含目的外源基因的农杆菌的制备
• 3)水稻愈伤与农杆菌的共培养
• 4)抗性愈伤组织的筛选
• 5)抗性愈伤组织的预分化培养
• 6)抗性愈伤组织的分化培养
• 7)转基因幼苗的生根培养与炼苗
• 1.8.4 转基因水稻苗的移栽
• 2、结果与分析
• 2.1 目的基因cDNA 的克隆及鉴定
• 2.2 β-石竹烯合成酶基因进化树分析
• 2.3 水稻OsCAS 基因的原核表达
• 2.4 水稻OsCAS 基因的诱导表达特征分析
• 2.5 水稻OsCAS 基因的遗传转化及转基因品系的获得
• 2.5.1 重组质粒pCAMBIA1301-OsCAS 和pMECE-OsCASRL 鉴定
• 1) 重组质粒pCAMBIA1301-OsCAS 鉴定
• 2) 重组质粒pMECE-OsCASR 和pMECE-OsCASRL 鉴定
• 2.5.2 转基因水稻品系的获得
• 3、讨论
• 第三章 水稻OSLIMS 基因克隆鉴定、原核表达及其遗传转化
• 1、材料与方法
• 1.1 水稻品种和虫源
• 1.2 菌株、酶、载体及试剂
• 1.3 水稻处理
• 1.4 水稻OsLIMS 基因的克隆及鉴定
• 1.4.1 水稻总RNA 的提取及电泳
• 1.4.2 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳
• 1.4.3 水稻cDNA 第一链合成
• 1.4.4 目的片段的扩增及PCR 产物的纯化
• 1)目的片段的扩增
• 2)PCR 产物的纯化
• 1.4.5 目的片段与T 载体的连接、转化与测序
• 1.5 水稻OsLIMS 基因的原核表达
• 1.5.1 融合表达载体pET32a（+）-OsLIMS 的构建
• 1)目的基因ORF 的扩增、鉴定及PCR 产物纯化
• 2)pET32a（+）质粒的提取
• 3) 目的片段与表达载体pET32a（+）的连接
• 4) 融合表达载体的转化及鉴定
• 1.5.2 融合蛋白的诱导表达
• 1.5.3 融合蛋白的SDS-PAGE 检测
• 1.6 农杆菌介导的遗传转化和转基因植株再生
• 1.6.1 过量表达载体和RNAi 载体的构建
• 1)目的片段的扩增、鉴定及PCR 产物的纯化
• 2)目的片段与pCAMBIA1301 载体和pMECE 载体的连接及转化
• 3)重组质粒pCAMBIA1301-OsLIMS 和pMECE-OsLIMSRL 的酶切及鉴定
• 1.6.2 重组质粒pCAMBIA1301-OsLIMS 和pMECE-OsLIMSRL 农杆菌的转化
• 1.6.3 农杆菌介导的遗传转化
• 1.6.4 转基因水稻苗的移栽
• 2、结果与分析
• 2.1 目的基因cDNA 的克隆及鉴定
• 2.2 柠檬烯合成酶基因进化树分析
• 2.3 水稻OsLIMS 基因的原核表达
• 2.4 水稻OsLIMS 基因的遗传转化及转基因品系的获得
• 2.4.1 重组质粒pCAMNBIA1301-OsLIMS 和pMECE-OsLIMSRL 鉴定
• 1) 重组质粒pCAMNBIA1301-OsLIMS 鉴定
• 2) 重组质粒pMECE-OsLIMSR 和pMECE-OsLIMSRL 鉴定
• 2.4.2 转基因水稻品系的获得
• 3、讨论
• 第四章 本研究的创新点及今后应努力的方向
• 1、本研究的创新点
• 2、今后应努力的方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢