炭疽杆菌A16R免疫蛋白质组学的研究

论文摘要

炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis, BA）引起的一种烈性人畜共患传染病。由于炭疽芽孢易于大量培养、极难被杀灭、可通过气溶胶途径传播,并且引起的吸入性肺炭疽死亡率较高等特点,所以长期以来一直被某些国家认为是首选的生物战剂。自美国“911”事件发生后,BA研究再次成为世界各国关注的热点。而预防炭疽最有效的方法是疫苗,所以炭疽疫苗的研究成为目前研究的热点,而从BA中筛选具有免疫原性的蛋白质则是疫苗设计的关键。本研究采用蛋白质组学研究方法,大规模筛选BA营养体和芽孢蛋白中可能存在的免疫原性蛋白质,这将为我们深化炭疽芽孢杆菌的认识,以及检测、诊断炭疽芽孢杆菌与对炭疽的早期治疗提供靶标。主要研究结果如下：以BA A16R菌株为实验菌株,采用固态培养,在含有200 mL的LB固态培养基的罗氏瓶内进行培养,先放于37℃的培养箱内正置一天后,再倒置于30℃培养箱内培养10-15 d,用4℃灭菌纯水清洗培养基表面,8000r／min离心10 min收集芽孢,直至复红美兰染色观察芽孢纯度达到98%为止。然后将收集的芽孢用2 mL的4℃灭菌纯水重悬,稀释涂板计数,得到芽孢浓度为5.5×109CFU／mL。以收集纯化的芽孢免疫4只新西兰大白兔,首次家兔腹股沟免疫,间隔14d后耳静脉免疫2次,后来采用皮下多点免疫,且免疫相隔7d,共免疫5次,以间接ELISA测定血清效价达到12800。免疫印迹实验验证了,所制备的血清可以与炭疽蛋白发生反应,所以制备出的血清为下一步筛选具有免疫原性的蛋白点提供了材料。采用超声裂解方法分别制备BAA16R菌株的营养体和芽孢蛋白样品,蛋白样品经双向电泳分离,电转膜后,用上述制备的多克隆抗体进行免疫印迹。然后将双向电泳的考马斯亮蓝染色胶图与免疫印迹曝光图匹配比对,找出匹配的蛋白点后,进行胶内酶切和质谱鉴定。结果表明,BA的营养体蛋白样品中有86个具有免疫原性的蛋白点,BA的芽孢蛋白样品中有13个具有免疫原性的蛋白点。在这些免疫原性的蛋白点中,19种蛋白质在以前的文献中被报导外,其他的蛋白质均未见报道。本研究结果为BA新疫苗的研发提供了新线索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1. 炭疽芽孢杆菌及其致病机理
• 1.1 生物学特性和流行病学
• 1.2 致病物质
• 1.2.1 荚膜
• 1.2.2 炭疽毒素
• 1.3 致病机制
• 2. 炭疽杆菌疫苗的研究
• 2.1 炭疽杆菌疫苗的研究现状
• 2.2 疫苗研究的问题和展望
• 3. 蛋白质组学简介
• 3.1 蛋白质组学的研究背景和意义
• 3.2 蛋白质组学的研究内容和技术
• 4. 炭疽芽孢杆菌的蛋白质组学研究
• 5. 本研究的目的和意义
• 第二章 炭疽杆菌芽孢的收集及多克隆抗体的制备
• 1.材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要化学试剂与器材
• 2. 方法
• 2.1 芽孢的收集和纯化
• 2.2 芽孢的复红美兰染色
• 2.3 芽孢悬液计数
• 2.4 动物免疫
• 2.5 PA-D4融合蛋白的表达
• 2.6 抗炭疽血清的制备及血清效价测定
• 2.6.1 抗血清的分离
• 2.6.2 间接ELISA测定血清效价
• 2.7 抗体特异性的检测
• 3. 结果与分析
• 3.1 芽孢的复红美兰染色
• 3.2 芽孢计数
• 3.3 PA-D4融合蛋白的表达
• 3.4 抗体效价的测定
• 3.5 抗血清的免疫印记分析
• 4. 讨论
• 第三章 炭疽杆菌A16R全菌体和芽孢免疫原性蛋白的研究
• 1. 材料
• 1.1 菌株
• 1.2 主要化学试剂与耗材
• 1.3 主要仪器与分析软件
• 2. 方法
• 2.1 细菌培养
• 2.2 蛋白样品的准备
• 2.2.1 营养体蛋白样品制备
• 2.2.2 芽孢蛋白的制备
• 2.3 双向电泳
• 2.3.1 蛋白样品纯化
• 2.3.2 等电聚焦
• 2.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）的配制
• 2.3.4 胶条的平衡与转移
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳
• 2.3.6 考马斯亮蓝染色和脱色
• 2.3.7 图像扫描与分析
• 2.4 半干转印
• 2.5 免疫印迹
• 2.6 胶内酶切
• 2.7 胰酶解肽段混合物的MALDI-TOF/TOF质谱检测
• 2.7.1 仪器
• 2.7.2 点靶
• 2.7.3 检测
• 2.8 数据库查询
• 2.9 蛋白质表达情况的分析
• 2.10 预测炭疽杆菌双向电泳图中蛋白分布
• 3. 结果与分析
• 3.1 炭疽杆菌A16R营养体蛋白的双向电泳
• 3.2 芽孢蛋白的双向电泳情况
• 3.3 免疫印迹结果
• 3.3.1 A16R营养体蛋白免疫蛋白质点的质谱鉴定结果
• 3.3.2 芽孢蛋白免疫蛋白质点的质谱鉴定结果
• 3.3.3 目前已经有文献报导具有免疫原性的蛋白（Emrah,2008;Chitlaru,2007;Mukhopadhyay,2009;Huang,2004;Ariel,2003;Liu,2004）
• 3.4 所鉴定蛋白质的细胞功能分类情况
• 3.5 所鉴定蛋白质的细胞定位情况
• 4. 讨论
• 4.1 炭疽杆菌相关的免疫原性蛋白
• 4.2 免疫蛋白质组学技术的优势与不足
• 第四章 总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 实验中所用仪器设备
• 附录2 培养基和试剂的配制
• 附录3 实验中所用试剂
• 附录4 所鉴定到的蛋白的相关信息
• 附录5 讨论中免疫原性蛋白点的双向电泳图和Western blotting曝光图
• 附录6 发表文章