丹参酮生物合成相关基因的克隆及其代谢调控

论文摘要

心脑血管疾病是威胁人类健康与生命的"头号杀手"。丹参（Salvia miltiorriza）为我国传统名贵中药材,其主要成分包括脂溶性的丹参酮化合物;而丹参酮是临床治疗心、脑血管疾病的重要药物资源,最近的研究还表明丹参酮具有抗癌作用,因此,丹参在临床上具有广泛的应用。然而,丹参可用资源有限及有效成分含量低使之应用受限。本研究以丹参为材料,在本实验室前期工作基础之上,利用RACE技术克隆丹参酮代谢合成关键酶基因,克隆得到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因（SmGGPPS, GenBank Accession No. FJ643617）和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因（SmHMGR, GenBank Accession No. EU680958）的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学和表达模式的分析及在大肠杆菌中对SmGGPPS进行了颜色互补功能验证。SmHMGR cDNA全长2115bp,包括1695bp的开放阅读框,编码565个氨基酸。氨基酸多重序列比对结果显示SmHMGR与其他植物的HMGR有较高的同源性。进化树分析表明,SmHMGR与胡黄连（Picrorhiza kurrooa） HMGR的亲缘关系最近。组织特异性表达分析结果表明,SmHMGR基因在丹参中为组成型表达,且根中的表达最强,茎中表达次之,叶片中表达最弱。水杨酸（SA）诱导实验表明,SmHMGR在叶片中受到水杨酸的诱导。甲基茉莉酸（MJ）诱导实验表明,SmHMGR在不同组织中都不同程度上受到诱导.暗示SmHMGR是一个诱导响应型的基因。SmGGPPS全长1234bp,包括1092bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。氨基酸多重序列比对结果显示SmGGPPS与其他植物的GGPPS有较高的同源性。进化树分析表明,SmGGPPS与烟草（Nicotiana attenuate） GGPPS的亲缘关系最近。在大肠杆菌中的功能验证表明SmGGPPS能够促进类胡萝卜素的合成,证明SmGGPPS编码一个有功能的蛋白。组织特异性表达分析结果表明,SmGGPPS基因在丹参中为组成型表达,且叶片中的表达最强,根中表达次之,茎中表达最弱。水杨酸（SA）诱导实验表明,SmGGPPS在叶片中也受到水杨酸的诱导。而甲基茉莉酸（MJ）诱导实验表明,SmGGPPS在不同组织中都受到MJ的抑制。暗示SmGGPPS也是一个诱导响应型的基因。继而采用RT-PCR和HPLC等技术,较全面地分析了不同诱导子如MJ、Ag+、YE、YE+Ag+等处理丹参毛状根前后丹参酮合成相关基因如SmHMGR, SmGGPPS, SmDXR, SmAACT, SmCMK, SmIPPI, SmFPPS, SmCPS,SmKSL等的表达与丹参酮积累的相关性,结果表明,丹参酮的生物合成在转录水平上受到调控,在不同诱导子处理下,丹参毛状根中丹参酮含量的积累可能是丹参酮代谢途径上的多个基因共同上调表达的结果。同时,SmHMGR, SmDXS2, SmFPPS, SmGGPPS和SmCPS被鉴定为调控丹参酮生物合成可能的关键酶基因。以上研究工作为进一步阐释不同诱导子调控丹参酮生物合成的分子机理及进一步提高丹参中丹参酮含量奠定了坚实基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 丹参及丹参酮概述
• 1.2 丹参酮的药源问题
• 1.3 丹参酮药源解决途径
• 1.3.1 毛状根培养技术
• 1.3.2 丹参毛状根研究概况
• 1.3.3 丹参酮代谢工程
• 1.4 丹参酮类化合物的生物合成途径及其相关催化酶
• 1.4.1 丹参甲羟戊酸（MVA） 途径及相关催化酶
• 1.4.2 丹参1-脱氧-D-木酮糖-5 磷酸（DXP） 途径及相关催化酶
• 1.4.3 丹参酮生物合成下游特异途径及相关催化酶
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 载体及菌种
• 2.1.3 主要设备仪器
• 2.1.4 购买的试剂盒、试剂、药品及酶等
• 2.1.5 实验常用试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 丹参无菌苗的扩繁
• 2.2.2 丹参总RNA 的提取与检测
• 2.2.2.1 准备工作
• 2.2.2.2 用RNAprep pure Plant kit 抽提丹参总RNA
• 2.2.2.3 RNA 纯度与浓度检测
• 2.2.3 丹参SmGGPPS、SmHMGR 基因全长cDNA 的克隆
• 2.2.3.1 3’RACE 模板的合成
• 2.2.3.2 3’端cDNA 片段扩增
• 2.2.3.3 5’RACE 模板的合成
• 2.2.3.4 5’端cDNA 片段扩增
• 2.2.3.5 扩增SmGGPPS ORF 片段及SmHMGR ORF 片段
• 2.2.4 SmGGPPS ORF 片段及 SmHMGR ORF 片段的回收及其回收产物分别与pMD-18T Vector 连接
• 2.2.5 连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
• 2.2.6 阳性克隆的筛选及测序鉴定
• 2.2.7 丹参SmGGPPS、SmHMGR 的组织表达分析
• 2.2.7.1 RNA 的提取
• 2.2.7.2 RT-PCR
• 2.2.8 丹参SmGGPPS、SmHMGR 在水杨酸和甲基茉莉酸处理下的表达分析
• 2.2.9 丹参SmGGPPS 原核表达
• 2.2.10 颜色互补实验验证丹参SmGGPPS 功能
• 2.2.11 不同诱导子对丹参毛状根中丹参酮生物合成相关基因表达和丹参酮积累的影响
• 2.2.11.1 丹参毛状根的悬浮培养
• 2.2.11.2 诱导子的制备
• 2.2.11.3 丹参酮类成分的提取和HPLC 含量测定
• 2.2.11.4 总RNA 的提取
• 2.2.11.5 cDNA 的合成和RT-PCR
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 总RNA 的提取
• 3.2 丹参SmGGPPS 基因的克隆和序列分析
• 3.2.1 SmGGPPS 的克隆
• 3.2.2 SmGGPPS 全长DNA 序列的获得
• 3.2.3 SmGGPPS 序列的生物信息学分析
• 3.2.4 SmGGPPS 在E.coli BL21（DE3）中的异源表达
• 3.2.5 在E.coli DH5α中验证SmGGPPS 功能
• 3.2.6 SmGGPPS 组织表达谱分析
• 3.2.7 水杨酸和甲基茉莉酸处理下SmGGPPS 表达模式分析
• 3.3 丹参SmHMGR 基因的克隆和序列分析
• 3.3.1 SmHMGR 的克隆
• 3.3.2 SmHMGR 序列的生物信息学分析
• 3.3.3 SmHMGR 组织表达谱分析
• 3.3.4 水杨酸和甲基茉莉酸处理下SmHMGR 表达模式分析
• 3.4 不同诱导子对丹参毛状根中丹参酮生物合成相关基因表达和丹参酮积累的影响
• 3.4.1 高效液相色谱（HPLC） 方法测定丹参酮含量的建立
• 3.4.2 不同诱导子对丹参酮（CT+T2A） 合成的影响
• 3.4.3 MJ 诱导子对丹参酮生物合成途径的影响
• + 诱导子对丹参酮生物合成途径的影响'>3.4.4 Ag⁺诱导子对丹参酮生物合成途径的影响
• 3.4.5 YE 诱导子对丹参酮生物合成途径的影响
• + 诱导子对丹参酮生物合成途径的组合效应'>3.4.6 YE 诱导子和Ag⁺诱导子对丹参酮生物合成途径的组合效应
• 3.4.7 讨论
• 3.4.7.1 丹参酮生物合成途径中5 个关键限速酶基因的初步推测
• 3.4.7.2 丹参酮生物合成途径中可能的关键酶基因之一SmHMGR
• 3.4.7.3 SmDXS 两个成员可能在丹参初生代谢和次生代谢中扮演不同角色
• 3.4.7.4 SmDXR 虽然参与丹参酮生物合成，但不一定是提高丹参酮的有效靶点
• 3.4.7.5 SmGGPPS 是丹参酮生物合成途径中的关键酶之一
• 3.4.7.6 SmCPS 应该也是丹参酮生物合成的关键限速酶基因之一
• 3.4.7.7 丹参SmKSL 在丹参酮生物合成中的作用有待于进一步验证
• 第四章 总结与展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 后续研究方向
• 附录图
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文及成果
• 致谢