rolB基因在棉花基因组中转录及转基因系耐旱性研究

论文摘要

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)由于其根系再生能力差,移栽成活困难,生产上常采用营养钵育苗移栽和地膜覆盖技术,以解决棉花移栽成活困难的问题,使棉花生育期提前。但即使采用营养钵育苗移栽,棉花缓苗期仍至少有15d,不仅影响了棉花早发,同时也影响了三桃(伏前桃、伏桃和秋桃)所占的比重,因而培育出生根力强的棉花新品种,对于棉花移栽早发、耐旱、防早衰、提高产量、改进品质具有重要意义。发根农杆菌(Agribacterium rhizogens)Ri质粒上含有诱发毛根形成的基因(rooting loci,rol)即rol基因。将Ri质粒上单个或几个rol基因导入植物基因组均能提高植物的生根能力。将源于发根农杆菌的人工重组生根基因(rolB基因)转移到陆地棉栽培品种中,已获得了具有较强生根能力的转基因植株。本实验以前期获得的rolB转基因棉花为材料,对各个转基因系进行了分子检测、转基因表达稳定性、抗旱性、种子休眠特性的研究,主要研究内容及结果如下:1.通过提取转基因及对照植株叶片总DNA,分别用NPTII和rolB基因的特异性引物进行了PCR检测,实验结果显示,各转化系植株叶片总DNA都扩增出特异性条带,与携带NPTII和rolB基因的质粒DNA阳性对照扩增出的特异条带一致,而对照植株叶片DNA没有扩增出相应的条带,证明rolB转基因系经过多代繁殖后,rolB转基因能够在棉花基因组中稳定遗传。2.通过提取转基因及对照植株同龄叶片总RNA,采用Northern杂交技术分析,结果表明,NPTII和rolB基因能在棉花基因组中正常表达,进一步证明rolB转基因在棉花基因组中的整合和表达具有很高的遗传稳定性。3.对转基因棉株的抗旱性研究结果表明:(1)转基因植株7343、7346、7342、7351和对照4105在移栽1个月内不同时间进行死亡株数、新叶大小、盛花期叶水势和脯氨酸累积含量的调查分析结果表明,转基因植株和对照之间无差异;(2)在苗期抗旱性鉴定结果中,4种转基因材料苗期成苗率均值在50%～75%之间,属于耐旱类型,而对照4105的苗期成苗率平均值为45%,属于不耐旱类型;(3)在茎粗的调查分析中得知:7343与对照4105的茎粗没有明显差别,而且4105与7346之间也无差别,但是7343的茎粗显著大于另外3个转基因种,7346则明显大于7351和7342,7342和7351之间没有差别;(4)根/冠比的调查分析结果:7343、7342、7351的根/冠比显著大于对照4105和7346,表明rolB转基因系的根系发育均比对照4105的根系发育强大。4.采用2种处理来研究转基因系种子的休眠特性:处理A为未经任何方法解除休眠的样品在25℃条件下发芽,处理B是将各样品在40℃高温下解除休眠1天后,在25℃条件下发芽。研究结果表明,处理A中所有材料的发芽势均高于处理B,但发芽率均低于处理B。在处理A中,4个转基因品种的发芽势和发芽率均低于对照4105,说明4个转基因品种的休眠性高于对照,其中7351、7342、7343和4105的发芽率为30%～50%,属于中度休眠;7347的发芽率为5%～30%,属于强休眠。在处理B中,4个转基因品种的发芽势低于对照,但7351的发芽率最高,对照4105和7342其次。不同转基因系之间在发芽势和发芽率方面的差异可能是rolB基因在棉花基因组中整合位点不同所致。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 转基因植物的鉴定方法
• 1.1.1 标记基因的使用
• 1.1.1.1 选择标记基因
• 1.1.1.2 报告基因
• 1.1.2 分子检测
• 1.1.2.1 分子标记
• 1.1.2.2 分子杂交
• 1.1.2.3 DNA芯片技术
• 1.1.3 免疫技术
• 1.1.3.1 酶联免疫法（ELISA）
• 1.1.3.2 免疫荧光技术
• 1.2 Ri质粒和rol基因的研究进展
• 1.2.1 发根农杆菌及Ri质粒
• 1.2.2 rol（rooting locus）基因发现及特征
• 1.2.3 Ri质粒或rol基因的转化对植物生长发育的影响
• 1.2.3.1 对根的形成与生长发育的影响
• 1.2.3.2 对地上部分的生长发育及形态的影响
• 1.2.4 Ri质粒rol基因在林木及园林植物遗传改良上的应用
• 1.2.4.1 利用Ri质粒rol基因来促进林木生根,提高植株生长量
• 1.2.4.2 转化单个rol基因,定向改变林木生长性状
• 1.2.4.3 利用rol基因转化植株的变异培育新品种
• 1.3 RNA提取方法的研究进展
• 1.4 棉花抗旱育种的研究现状
• 1.4.1 棉花抗旱的形态学指标
• 1.4.2 棉花抗旱的生理生化指标
• 1.5 课题研究的目的及意义
• 第二章 转rolB基因棉株的分子鉴定和表达分析
• 2.1 转rolB基因棉株的PCR分子鉴定
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.1.1 棉花材料
• 2.1.1.2 根癌农杆菌和转化载体
• 2.1.1.3 部分试剂来源
• 2.1.1.4 培养基
• 2.1.1.5 仪器和设备
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 菌液的制备
• 2.1.2.2 质粒DNA的提取
• 2.1.2.3 小量法抽提棉花DNA（PEX法）
• 2.1.2.4 棉花基因组DNA的提取（CTAB大量法）
• 2.1.3 转化植株的PCR检测
• 2.2 转rolB基因棉花的基因表达分析
• 2.2.1 棉花基因组总RNA的抽提
• 2.2.2 转化植株的Northern杂交检测
• 2.2.2.1 Northern杂交前的准备和试剂
• 2.2.2.2 RNA的提取
• 2.2.2.3 RNA的电泳分离和Northern转移
• 2.2.2.4 预杂交
• 2.2.2.5 探针的制备及标记
• 2.2.2.6 杂交
• 2.2.2.7 洗膜
• 2.2.2.8 压片及成像
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 转基因植株的PCR检测
• 2.3.2 转基因植株的Northern杂交检测
• 2.3.2.1 转基因植株总RNA的提取
• 2.3.2.2 Northern杂交检测
• 2.4 结论
• 第三章 转rolB基因棉花抗旱性和种子休眠特性研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 转基因棉花抗旱性的调查研究
• 3.2.2 种子休眠特性研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 转基因棉花抗旱性调查结果
• 3.3.1.1 在移栽1个月内不同时间进行死亡株数的调查
• 3.3.1.2 反复干旱法苗期抗旱性鉴定
• 3.3.1.3 进行新叶大小的分析
• 3.3.1.4 在盛花期进行叶水势和脯氨酸累积含量的测定
• 3.3.1.5 棉花茎粗的调查与分析结果
• 3.3.1.6 根/冠比的调查与分析
• 3.3.2 种子休眠特性研究结果
• 3.4 小结和讨论
• 3.4.1 小结
• 3.4.2 讨论
• 第四章 全文讨论
• 4.1 转基因植株的分子生物学检测
• 4.1.1 转基因植株的PCR检测
• 4.1.2 棉花RNA的提取
• 4.1.3 转基因植株的Northern杂交检测
• 4.2 棉花抗旱育种探讨
• 4.3 rol基因的应用潜力
• 4.4 转基因表达情况
• 参考文献
• 致谢