表达猪链球菌2型毒力因子EF和SLY二价候选疫苗株的构建

论文摘要

猪链球菌2型（Streptocuccus suis2, S S2）在自然界中分布广泛,传染性强,可以感染猪和人类,引起猪链球菌病。经研究,猪链球菌的致病因子主要包括溶血素（Streptolysin, SLY）,细胞外蛋白因子（Extracellular proteins factor, EF）,溶菌酶释放蛋白（Muramidase released protein, MRP）,荚膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS）等。这几种毒力因子的合成分别受sty、ef和mrp基因控制,为了研究这几种毒力因子与猪链球菌致病性之间的关系,制备能够合成这几种毒力因子的重组菌,从而更进一步制备针对猪链球菌的疫苗株,我们进行了研究。本实验是通过分子克隆手段,首先将SS2的ef基因构建在工程质粒pGEX-6P-1中,构建含有ef基因片段的重组质粒pZH01,将pZH01转入大肠杆菌BL21（DE3）中。之后将asd基因连入pZH01之中,构建重组质粒pZH02,将pZH02转入大肠杆菌X6097中。asd基因可以控制生成DAP, DAP是细胞壁组成物质,X6097是营养缺陷型细菌,不能合成DAP,含有asd基因的重组质粒pZH02与宿主菌X6097构成宿主平衡致死系统,可以有效对重组菌落进行筛选。第三步将sly基因连接到pZH01中,构建重组质粒pZH03, pZH03转入大肠杆菌DH5a中。最后,利用向工程质粒PGEX-6P-1改造而来的质粒pGEX-6P-1A中单独的连入sly基因,得到只含有sly基因的重组质粒pGEXSLY,将pGEXSLY转入到大肠杆菌JM109中,重组菌在血平板上进行溶血试验测定其溶血活性。通过这几步,分别得到含有ef, asd和ef, sly以及单独的sly基因的重组质粒。通过Amp抗生素和宿主平衡致死系统方法对重组菌落进行筛选,进一步对重组质粒进行鉴定。最终,利用灭活的猪链球菌进行家兔的免疫试验,得到猪链球菌的抗血清,测定抗血清的效价。本实验最终构建出了含有ef和sly两种毒力因子的重组质粒,为后期ef和sly蛋白的表达与鉴定,以及针对猪链球菌毒力因子疫苗株的制备提供了有效的技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 一、概述
• 1、猪链球菌概述
• 1.1 链球菌综述
• 1.2 猪链球菌概述
• 2、链球菌的分类
• 2.1 猪链球菌根据链球菌的分类
• 2.2 根据C抗原构造不同的分类
• 2.3 根据对氧需求分类
• 3、猪链球菌形态学特征
• 4、猪链球菌病的流行现状
• 5、猪链球菌致病因子
• 5.1 溶血素（Streptolysin,SLY）
• 5.2 细胞外蛋白因子（Extracellular proteins factor,EF）
• 5.3 溶菌酶释放蛋白（Muramidase released protein,MRP）
• 5.4 荚膜多糖（Capsular polysaccharide,CPS）
• 5.5 IgG结合蛋白
• 5.6 44KD蛋白
• 5.7 特异型鞭毛
• 6、国内外研究现状
• 7、ASD简介
• 8、本实验的目的和意义
• 二、实验部分
• 1、含有ef基因的重组质粒pZH01的构建
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 分析与讨论
• 2、含有asd基因的重组质粒pZH02的构建
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 分析与讨论
• 3、sly基因转入重组质粒pZH01中
• 3.1 材料和试剂
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 分析与讨论
• 4、Sly基因导入到pGEX-6p-1A载体中
• 4.1 材料和试剂
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 分析与讨论
• 5、猪链球菌抗血清的制备与抗体效价的测定
• 5.1 材料和试剂
• 5.2 方法
• 5.3 结果
• 5.4 分析与讨论
• 三、讨论与总结
• 3.1 讨论
• 3.2 总结
• 参考文献
• 后记