丹参GGPP合酶基因的克隆及表达分析

论文摘要

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国一种药用植物,以根及根茎入药,具有活血调经、祛癖生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功效,被广泛应用于冠心病、脑血管病、肝炎、肝硬化、慢性肾衰竭、月经不调和心烦不眠等病症。丹参的有效成分可分为两大类:一类是水溶性酚酸类物质,包括丹酚酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯和原儿茶醛等;另一类是脂溶性二萜醌类化合物,包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮和二氢丹参酮等。丹参酮类物质多属于二萜醌类化合物。牻牛儿基牠牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyldiphosphate synthase,GGPPS）是高等植物二萜类物质合成的限速酶之一,调控着代谢分支点前体牠牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate,GGPP）向二萜类物质的合成。本研究采用简并引物和染色体步移法克隆了丹参中GGPP合酶基因（命名为:SmGGPPS）,对该基因的序列以及启动子区域的调控信息进行了生物信息学分析,应用实时定量PCR方法,对该基因在不同器官、不同环境因子影响下的表达情况进行了探讨;采用可上调SmGGPPS基因表达的因子处理丹参植株,并用HPLC技术检测了在这些因子影响下丹参二萜类物质合成的变化。本研究为进一步阐明丹参二萜类化合物（丹参酮类）的生物合成机制及其调控提供一定的资料。主要研究结果如下:1.利用简并性引物并结合染色体步移法从丹参DNA水平和cDNA水平克隆了丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因（SmGGPPS）。基因全长2758 bp,包含1个内含子序列;开放读码框1086 bp,编码361个氨基酸（氨基酸序列命名为:SmGGPPS）。SmGGPPS在核酸水平和编码氨基酸水平与已报道的其它植物中同源的GGPP合酶基因都有很高的一致性（达64%以上）。2.SmGGPPS编码氨基酸含有一个转异戊烯基焦磷酸合酶（Trans-isoprenyl diphosphatesynthases）结构域,属于转异戊烯基焦磷酸合酶蛋白家族成员。具有GGPP合酶家族的两个富含天冬氨酸的特征性序列:DDXXXXD和DDXXD。生物信息学分析显示该多肽序列N端含有叶绿体转运肽片段,是亲水的叶绿体蛋白,螺旋结构是其主要高级结构单元。3.丹参SmGGPPS基因5’端侧翼序列（1095 bp片段）,除包含启动子核心元件和组织特异性表达相关作用元件外,还有与损伤、干旱、热、GA、SA、ABA和病原菌等诱导相关的顺式作用元件。推测SmGGPPS基冈的表达可能受到光、高温、病原菌浸染、损伤、植物激素（GA、ABA和SA）、盐溶液等因子的调控。4.基因表达分析显示,丹参SmGGPPS基因主要在叶中特异表达:黑暗、高温、病原菌、机械损伤,盐溶液（200 mM NaCl溶液）、赤霉素（50 mM GA3）、脱落酸（100 mM ABA）和水杨酸（5 mM SA）等几种因子可诱导该基因的表达上调。5.NaCl溶液（500 mM）、高温、GA3（50 mM）和SA（10 mM）等四种因子可促进丹参中丹参酮类化合物成分的积累,其中SA（10 mM）的效应最高,约是对照组的3倍;ABA（100mM）和黑暗虽然可以诱导丹参GGPP合酶基因表达上调,但对丹参酮类化合物积累的促进效应不明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 概述
• 1 植物次生代谢产物
• 1.1 植物次生代谢产物的种类
• 1.1.1 萜类化合物
• 1.1.2 酚类化合物
• 1.1.3 含氮化合物
• 1.2 植物各类次生代谢物的主要合成途径及其关键酶
• 1.2.1 萜类合成途径
• 1.2.2 酚类
• 2 丹参有效成分及其功效
• 2.1 丹参脂溶性成分
• 2.2 丹参水溶性成分
• 3 丹参脂溶性成分合成调控研究
• 3.1 诱导丹参多倍体提高丹参酮含量
• 3.2 通过组织、细胞培养生产丹参酮类化合物
• 3.3 基因工程的应用
• 3.4 丹参毛状根培养
• 4 实时荧光定量PCR在分子检测中的应用
• 4.1 荧光定量PCR原理
• 4.2 荧光定量PCR的分类
• 4.2.1 荧光染料
• 4.2.2 水解探针
• 4.2.3 分子信标
• 4.3 定量方法
• 4.3.1 绝对定量
• 4.3.2 标准曲线法的相对定量
• 4.3.3 比较Ct值的定量方法
• 5 染色体步移法
• 6 GGPP合酶及其基因研究概述
• 6.1 GGPP合酶蛋白的定位
• 6.2 GGPP合酶基因的克隆情况
• 6.3 GGPPS基因的表达及调控
• 7 研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 1 丹参GGPP合酶基因的克隆
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 丹参GGPP合酶基因的克隆及序列分析
• 2.1.1 丹参GGPP合酶基因核心序列的获得
• 2.1.2 丹参GGPP合酶基因3'端侧翼序列的获得
• 2.1.3 丹参GGPPS基因5'端侧翼序列的获得
• 2.1.4 丹参GGPPS基因全序列的获得
• 2.2 丹参SmGGPPS 5'端侧翼序列调控信息分析
• 2.3 Southern杂交分析
• 2.3.1 探针标记
• 2.3.2 杂交
• 2.4 丹参GGPP合酶基因的表达分析
• 2.4.1 植物材料及处理
• 2.4.2 不同处理材料总RNA的提取及第一链cDNA的合成
• 2.4.3 cDNA第一链的获得
• 2.4.4 利用实时定量PCR分析SmGGPPS在丹参中的表达
• 2.5 不同因子影响下丹参脂溶性成分含量的变化测定
• 2.5.1 植物材料及处理
• 2.5.2 脂溶性成分的提取
• 2.5.3 对照品配制
• 2.5.4 样品测定
• 第三章 结果与讨论
• 1 丹参GGPP合酶基因的克隆及其生物信息学分析
• 1.1 SmGGPPS基因的克隆及结构
• 1.2 SmGGPPS基因编码蛋白分析
• 1.2.1 SmGGPPS基本性质及特征分析
• 1.2.2 多序列比对分析
• 1.2.3 疏水性/亲水性的预测和分析
• 1.2.4 SmGGPPS转运肽分析
• 1.2.5 SmGGPPS高级结构预测
• 1.2.6 丹参SmGGPPS分子进化分析
• 2 丹参SmGGPPS基因的Southern杂交分析
• 3 丹参SmGGPPS基因5'侧翼序列调控信息分析
• 4 丹参SmGGPPS基因表达分析
• 4.1 丹参SmGGPPS基因器官特异性表达
• 4.2 丹参SmGGPPS基因的诱导表达
• 4.2.1 环境相关因子的影响
• 4.2.2 植物激素对丹参SmGGPPS表达的影响
• 4.3 丹参SmGGPPS基因的诱导表达小结
• 5 不同影响因子下丹参脂溶性成分含量变化
• 5.1 对照品图谱
• 5.2 不同因子影响下丹参脂溶性成分含量的测定
• 5.3 小结
• 6 SmGGPPS的表达和丹参酮含量变化关系的讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 读学位期间的研究成果