Pur α与Egr1对Aβ前体蛋白（APP）的转录调控研究

论文摘要

目的:Purα是嘌呤富集区元件结合蛋白家族的一个成员,它结合形如（GGNGGN）n的单链DNA或RNA串联序列,在神经系统发育,神经退行性病变如脆弱X染色体综合征、RNA病毒感染、DNA复制与修复、RNA转运等方面发挥着重要作用。Egr1是神经活动激活的早期表达蛋白,它对长期记忆的形成是必须的,在神经可塑性基因调节网络中发挥着关键作用。APP是一种单跨膜蛋白,它的代谢产物Aβ是Alzheimer病中主要病理产物,被认为在AD发病过程中起着关键作用,而APP本身也在神经系统正常功能维持中起着重要作用。本实验室的前期研究发现,Purα能下调APP的表达,而Egr1则能上调APP的启动子活性,两者作用正好相反。我们通过生物信息学比对发现,在APP启动子的5’UTR区中,Purα结合区域与Egr1结合区域有重叠,因此我们猜测Purα和Egr1对于APP启动子的转录调节可能是通过竞争相互重叠的结合位点实现的,我们的研究则围绕这一推测展开。方法:（1）western blot方法证实Purα和Egr1对APP的相反的调控作用;（2）通过免疫荧光染色实验验证Purα和Egr1是否共存于细胞核内;（3）分别克隆APP的（-170-+147）区域、（-100-+147）区域及其缺失（+63-+82序列的-100-+147）区域的启动子区DNA,构建PGL3-Basic荧光素酶的报告质粒。（4）通过荧光素酶报告基因方法分析上述三个报告质粒,验证Purα和Egr1对APP启动子区的竞争性调控机制。（5）通过CHIP assay验证Purα和Egr1蛋白和APP启动子DNA的结合。（6）通过EMSA实验进一步验证Purα和Egr1蛋白与APP启动子区结合的精确区域。结果:（1）Purα和Egr1对APP蛋白表达的调控作用正好相反,前者下调而后者上调;（2）免疫荧光染色证实Purα和Egr1能在细胞中共定位;（3）在报告基因实验中,Purα和Egr1对两段APP启动子片段（-170-+147片段）和（-100-+147）,其调控作用正好相反,Purα起下调作用,而Egr1则起上调作用;（4）在使用删掉两者重叠的(+63-+82区域的APP启动子片段进行报告基因实验中,发现Purα和Egr1对APP启动子的调节作用都消失;（5）CHIP assay实验证实Purα和Egr1蛋白均对APP的启动子DNA有结合作用;（6）EMSA实验则进一步证实APP启动子区域的+63-+89序列能被Purα和Egr1蛋白结合,并且二者的结合互相竞争。结论:Purα和Egr1通过竞争APP基因5’UTR区重叠的结合位点,实现对APP基因的相反方向的调节。目的:癫痫持续状态是指一次癫痫发作持续30分钟以上。它一种破坏性极强的致命性疾病,临床死亡率很高。在临床实践中,癫痫,中枢神经系统感染,外伤,医源性因素等均可引起癫痫持续状态。目前对影响癫痫持续状态发生和进展的分子机制知之甚少。但最近十年,越来越多的证据表明,GABA信号通路在癫痫持续状态中发挥着重要作用,GABA受体表达的变化在癫痫持续状态的发生和发展中起着非常重要的作用,但作为GABA合成的限速酶GAD67,在癫痫持续状态中的表达变化及其作用,我们知之甚少。我们这部分工作研究癫痫持续状态中GAD67的表达变化及其机制。方法:我们利用海人藻酸的癫痫模型和KCl处理的神经元,（1）我们利用免疫荧光确定G9a是否在GABA中间神经元中表达（2）用Western blot的办法研究了在急性癫痫发作和KCl处理的情况下,组蛋白甲基化相关的基因和GAD67是否发生变化。（3）我们利用组蛋白H3K9甲基化抑制剂BIX01294处理的神经元,研究H3K9甲基化的抑制是否会引起GAD67的改变。（4）我们接着用CHIP assay证实了H3K9甲基化酶G9a是否能和GAD67的启动子有直接相互作用。结果:（1）海人酸引起的癫痫持续放电能够下调表观遗传分子G9a的表达,同时降低组蛋白H3K9的甲基化。伴随他们的是,GABA递质产生的限速酶GAD67表达水平上调。（2）用G9a特异性抑制剂BIX01294足以在培养神经元中引起GAD67上调。（3）CHIP assay实验证实G9a能和GAD67启动子区域相互作用.结论:癫痫持续状态能通过G9a下调表观遗传标志组蛋白H3K9甲基化,进而引起GAD67表达水平上调。

论文目录

• 第一部分: Pur α 与Egr1 对Aβ前体蛋白（APP）的转录调控研究
• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 第二部分工作：癫痫持续状态对组蛋白H3K9 甲基化的影响及其作用
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 个人简历