转录因子在棉纤维起始期的表达特征及三个转录因子基因的克隆与功能初步分析

论文摘要

棉花是世界上最重要的经济作物之一,是纺织工业原材料的重要来源。棉纤维由胚珠外珠被表皮单层细胞发育而来,在整个生长过程中无细胞分裂。因此,棉纤维细胞就成为研究植物细胞分化、细胞形态建成以及细胞壁合成的理想材料。植物在其生长发育过程中,之所以会出现细胞的分化,是因为细胞内各种基因的表达有着时间和空间上的差异,导致这种差异的主要因素之一就是转录因子在转录水平上的调节作用。我实验室前期以无绒无絮突变体XinWX.无绒有絮突变体XinFLM的-1DPA,0DPA,+1DPA的胚珠为研究材料,基于芯片技术及生物信息学分析,获得一批在纤维起始期差异表达的基因。本研究进一步选择104个转录因子类的差异表达基因,根据芯片差异EST序列信息设计qPCR特异引物,其中81对引物可以获得扩增产物,利用qPCR技术定量验证这类基因在纤维发育早期的表达情况。通过（XinWX, XinFLM两种材料的）qPCR分析验证得到差异基因75个,占总体92.59%。差异基因中与芯片分析的差异基因符合数为56个,符合率为：69.14%。对芯片的验证结果表明,运用基因芯片筛选差异表达基因存在一定的假阳性,但大多数差异表达基因还是稳定和可靠的,为今后进一步研究棉纤维发育功能基因组学奠定了扎实的基础。从陆地棉中分离了3个转录因子基因,包括2个ZFP类基因和1个AP2/EREBP类基因,分别命名为GhZFP4, GhZFP5和GhAP2/EREBP4. GhZFP4编码属于PLATZC超家族的锌指蛋白,暂时没有发现GhZFP5编码的蛋白的保守域,GhAP2/EREBP4编码属于Polyketide-cyc2超家族的AP2/EREBP蛋白。这3个转录因子的ORF全长分别为663 bp、744 bp和561bp,分别编码220、247和186个氨基酸,蛋白质理论上的等电点和分子量分别为9.12/25.1 kD,8.09/26.3 kD,6.39/21.0 kD。亚细胞定位显示,GhZFP4、GhZFP5和GhAP2/EREBP4均被定位在细胞核上。选用了4个无绒无絮突变体（新乡小吉无绒无絮突变体XinWX、XZ142WXWX、MD17、SL1-7-1）、2个无绒有絮突变体（新乡小吉无绒有絮XinFLM、N1N1）和一个野生型材料（TM-1）进行棉花纤维初始发育和伸长发育早期转录因子的表达分析。结果发现这3个基因均在根、茎、叶以及纤维发育起始期和纤维伸长期表达量较高。这3个基因在野生型材料与突变体中的表达存在一定差异,GhZFP4和GhZFP5在野生型材料TM-1中的表达低于在突变体MD17,SL1-7-1,XZ142WXWX和N1N1中的表达,可能对纤维发育有抑制作用。GhAP2/EREB P4在XinFLM中的表达高于在XinWX中的表达,可能对纤维发育有促进作用。采用荧光定量PCR方法检测这3个基因在逆境胁迫（包括干旱、盐、ABA、冷、H202）中的表达情况。结果表明：GhZFP4和GhAP2/EREBP4受ABA.NaCl.低温和H202胁迫后表达都比对照组显著升高,但在干旱胁迫下表达水平与对照相比无显著差异; GhZFP5在受干旱、ABA.NaCl.低温和H202胁迫后表达都比对照组显著升高。这3个基因可能在棉花的非生物胁迫中起作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用缩略语
• 第一部分 文献综述
• 第一章 棉纤维发育及相关基因研究进展
• 1 棉纤维细胞发育过程概述
• 1.1 棉花纤维起始研究进展
• 1.2 棉花纤维伸长研究进展
• 1.3 棉花纤维细胞的次生壁合成和增厚研究进展
• 1.4 棉花纤维成熟期研究进展
• 2 棉纤维发育相关基因的研究进展
• 第二章 植物功能基因组学研究进展
• 1 基因克隆方法概述
• 1.1 通过PCR相关技术获取目的基因
• 1.2 通过建立基因文库分离目的基因
• 1.3 基因的图位克隆
• 1.4 转座子或T-DNA标签法克隆基因
• 1.5 mRNA差异显示表达分析法克隆特异表达基因
• 1.6 基于EST序列的电子克隆
• 1.7 功能克隆
• 2 基因时空表达研究
• 3 基因功能鉴定与验证
• 4 基因芯片技术
• 5 棉花功能基因组学
• 第三章 非生物胁迫相关基因
• 1 植物逆境胁迫抗性的功能基因组研究
• 2 逆境胁迫相关转录因子
• 2.1 MYB类转录因子
• 2.2 bZIP类转录因子
• 2.3 NAC类转录因子
• 2/EREBP类转录因子'>2.4 AP₂/EREBP类转录因子
• 2.5 ZFP研究进展
• 第四章 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究报告
• 第五章 转录因子在棉纤维起始期的表达特征
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果分析
• 2.1 芯片结果中差异表达转录因子基因的符合率验证
• 2.2 不同转录因子基因芯片验证及分析
• 2.3 转录因子基因在纤维起始发育期的表达谱
• 3 讨论
• 3.1 芯片结果中差异表达基因在亲本中验证
• 3.2 转录因子在棉花起始发育期表达
• 3.3 转录因子的表达是纤维启动的必要条件,滞后表达影响纤维启动功能
• 第六章 3个转录因子基因的克隆与功能初步分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 同源EST检索、拼接与分析
• 1.2.2 引物的设计与合成
• 1.2.3 棉花总RNA的提取与cDNA的合成
• 1.2.4 棉花基因组DNA的提取
• 1.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化和克隆检测
• 1.2.6 质粒的提取与检验
• 1.2.7 序列的PCR扩增、回收、克隆和测序
• 1.2.8 植物材料的非生物胁迫处理
• 1.2.9 实时荧光定量PCR分析
• 2 结果与分析
• 2.1 基因序列获得及生物信息学分析
• 2.2 亚细胞定位
• 2.3 纤维发育相关表达分析
• 2.4 抗逆相关表达分析
• 3 讨论
• 2/EREBP4可能与纤维发育相关'>3.1 GhZFP4,GhZFP5和GhAP₂/EREBP4可能与纤维发育相关
• 2/EREBP4可能与抗逆相关'>3.2 GhZFP4,GhZFP5和GhAP₂/EREBP4可能与抗逆相关
• 2/EREBP4的亚细胞定位'>3.3 GhZFP4,GhZFP5和GhAP₂/EREBP4的亚细胞定位
• 全文结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢