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草鱼穿孔素等基因的克隆、表达特性及功能分析

2020-12-08阅读(132)

草鱼穿孔素等基因的克隆、表达特性及功能分析

论文摘要

穿孔素,又称成孔蛋白（pore forming protein,PFP）,是一种由激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤细胞（NK）所产生、具有很强溶胞活性的糖蛋白。穿孔素的溶细胞作用是机体杀伤病毒和其他微生物感染细胞以及肿瘤细胞的一种效应机制,在机体非特异性免疫中起重要作用。为了解鱼类穿孔素的功能,本文根据穿孔素基因序列特征,克隆了草鱼（Ctenopharyngodon idellus）穿孔素基因C端包含1个完整蛋白激酶C保守结构域（C2）的cDNA,同时运用PCR定点突变的方法构建了点突变型（D429A, D435A, D483A, D485A）的cDNA。将cDNA与载体pET32a连接后转化表达菌诱导表达。His-Hind亲和柱纯化获得了野生型表达多肽（PFP-C）及4个点突变型蛋白。将野生型和4个点突变型蛋白分别与兔红细胞共育,观察穿孔素的溶细胞作用。野生型PFP-C具有Ca2+依赖性的溶血功能,且在pH 7.5时活性最大。而在Fe3+、Mg2+存在时,不能使兔血红细胞产生溶血。4个点突变型蛋白不能使兔血红细胞产生溶血现象,说明这4氨基酸残基突变后导致Ca2+不能与之结合,从而丧失了溶血活性。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是细胞内的一种应急蛋白,它通过对细胞内、外胁迫因子产生强烈的应答而调节内质网稳态。草鱼GRP78全长cDNA为2490 bp。其中,5’非编码区为155 bp,含有7个热休克元件,3’非编码区为373 bp,最大开放阅读框为1962 bp,编码653 aa的蛋白质。序列分析表明草鱼GRP78的N端包含3个HSP70家族的签名序列,C末端为内质网蛋白滞留信号KDEL。草鱼GRP78与人及其它动物的同源性很高。适应性进化分析也显示GRP78非常保守,受到强烈的功能约束,说明该蛋白质在进化中非常重要。RT-PCR分析表明,相对于本底水平,34℃热激和Poly I:C诱导后,草鱼GRP78在肝、肾等组织中的表达明显上调。草鱼Annexin A4全长cDNA为1307 bp,其中,5’非编码区为104 bp,3’非编码区为237 bp,开放阅读框为966 bp,编码321个aa。草鱼Annexin A4 N端由15个氨基酸残基组成,C端具有4个重复序列,每个重复序列都有1个Ⅱ型钙结合位点,在第4个钙结合位点中包含1个"KGD"序列。Annexin A4在草鱼肝、肾、脾、心、鳃、肠中的表达量均较高,而肌肉和脑中不表达。Poly I:C诱导后,其表达均有所下调。系统发育树显示,草鱼Annexin A4与斑马鱼的进化距离最近。适应性进化分析没有检测到正选择位点,表明Annexin A4非常保守,受到强烈的功能约束。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1 穿孔素
  • 1.1 穿孔素的结构特征
  • 1.2 穿孔素的作用机制
  • 1.3 穿孔素的生物学功能
  • 2 GRP78
  • 2.1 GRP78与生长发育
  • 2.2 GRP78与肿瘤
  • 3 膜联蛋白
  • 3.1 Annexins的结构特征
  • 3.2 Annexins的分布
  • 3.3 Annexins与膜
  • 3.4 Annexins与疾病
  • 4 本研究的目的和意义
  • 第二章 草鱼穿孔素基因C端的克隆、表达及其功能分析
  • 1 引言
  • 2 材料与设备
  • 2.1 主要仪器设备
  • 2.2 主要试剂、试剂盒
  • 2.3 质粒和菌株
  • 3 实验方法
  • 3.1 草鱼穿孔素C端的分子特征分析
  • 3.2 草鱼穿孔素C端目的cDNA片段的克隆
  • 3.3 目的基因片段的链接与鉴定
  • 3.4 PFP-C定点突变
  • 3.5 原核表达
  • 3.6 表达产物的纯化
  • 3.7 蛋白质浓度的测定
  • 3.8 重组穿孔素基因的溶血活性分析
  • 4 结果与分析
  • 4.1 草鱼穿孔素C端的分子特征
  • 4.2 草鱼穿孔素C端目的片段的克隆
  • 4.3 PCR法定点突变
  • 4.4 草鱼穿孔素C端的原核表达及纯化
  • 4.5 PFP-C浓度的测定
  • 4.6 重组PFP-C的溶血活性分析
  • 5 讨论
  • 第三章 草鱼GRP78基因的克隆、表达特性及进化
  • 1 引言
  • 2 实验材料
  • 2.1 试剂
  • 2.2 材料
  • 2.3 相关软件
  • 3 实验方案
  • 3.1 草鱼各组织总RNA的提取
  • 3.2 草鱼GRP78基因的克隆
  • 3.3 草鱼GRP78的分子特征
  • 3.4 GRP78适应性进化
  • 3.5 草鱼GRP78基因的组织表达特征
  • 4 结果
  • 4.1 草鱼GRP78的克隆
  • 4.2 草鱼GRP78分子特征
  • 4.3 草鱼GRP78分子适应性进化分析
  • 4.4 草鱼GRP78的组织表达
  • 5 讨论
  • 第四章 草鱼Annexin A4基因的克隆、表达特性及进化
  • 1 引言
  • 2 材料
  • 3 实验方法
  • 3.1 草鱼Annexin A4基因的克隆
  • 3.2 草鱼Annexin A4的分子特征分析
  • 3.3 Annexin A4适应性进化
  • 3.4 草鱼Annexin A4的组织表达
  • 4 结果与分析
  • 4.1 草鱼Annexin A4的克隆
  • 4.2 草鱼Annexin A4分子特征
  • 4.3 草鱼Annexin A4分子适应性进化分析
  • 4.4 草鱼Annexin A4基因的组织表达
  • 5 讨论
  • 第五章 小结
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录1:缩略语
  • 附录2:论文列表

    • 相关论文文献

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