重组人粒细胞集落刺激因子脂质体的研究

论文摘要

重组人粒细胞集落刺激因子（Recombinant Human Granulocyte Colony StimulatingFactor,rhG-CSF）是用DNA重组技术制备的蛋白质多肽类生物技术药物,可促进粒细胞集落的形成和造血干细胞向白细胞分化、增殖和成熟,并作用于成熟的中性粒细胞,延长其寿命,增强其游走、吞噬活性。由于口服给药易受消化液、酶系统及菌群的分解破坏,稳定性差,生物利用度低,目前国内外临床均采用注射给药。rhG-CSF在体内清除快,半衰期短,注射给药病人的依从性差。采用现代药物制剂新技术,选用rhG-CSF为模型药物,以脂质体为载体,设计前体脂质体法（pro-liposomes）,研制成重组人粒细胞集落刺激因子脂质体（RecombinantHuman Granulocyte Colony Stimulating Factor liposomes,rhG-CSF-Lip）新剂型。脂质体具有类生物膜结构,有着良好的细胞亲和性和组织相容性。将蛋白质类药物rhG-CSF包裹在脂质双分子层中,不仅可避免体内各种酶的破坏,提高药物的稳定性,且药物从脂质体中缓慢释放,可有效地延长药物的生物半衰期,达到长效目的,具有很高的科学技术价值和实践应用前景。主要研究内容及结果:1.rhG-CSF-Lip处方与制备工艺研究采用前体脂质体法制备rhG-CSF-Lip,在单因素考察的基础上进行均匀设计,优化筛选最佳处方与制备工艺;采用电子显微镜观察脂质体的物理外观形态,激光散射粒度分布与电势分析仪测定脂质体的粒径、粒度分布和Zeta电位,以生物活性法测定脂质体的载药量和包封率。结果:制得rhG-CSF-Lip物理外观圆整、分布均匀,算术平均粒径为（195.2±40.8）mm,粒径分布在125～250nm范围内;载药量为（4.95±0.08）%;包封率为（84.3±0.75）%;Zeta电位为—（45.5±2.97）mV。2.rhG-CSF-Lip质量控制方法与标准的研究建立了rhG-CSF-Lip质量控制的生物活性测定方法:利用人粒细胞集落刺激因子（Human Granulocyte Colony Stimulating Factor,rhG-CSF）依赖细胞株NFS-60在不同浓度G-CSF下的生长情况,与标准品对比得出rhG-CSF的含量,测定的rhG-CSF含量是具有生物活性的rhG-CSF。在测定细胞的范围内,rhG-CSF浓度的对数剂量与吸收度线性关系良好,线性方程为:Y=0.2859logX-0.4806（r=0.9999）;日内精密度（低、中、高浓度）RSD分别为0.72%、0.47%、0.56%;日间精密度（低、中、高三浓度）RSD分别为0.75%、0.44%、0.61%;回收率（低、中、高浓度）分别为（99.21±0.70）%、（99.39±0.61）%、（99.51±0.51）%,RSD分别为0.70%、0.62%、0.52%;加样回收率（低、中、高浓度）分别为（100.1±0.86）%、（99.8±0.8）%、（100.2±0.73）%。3.体外释药动力学及初步稳定性研究rhG-CSF脂质体的体外释放数学模型可用双相动力学方程拟合,回归方程为100-Q=0.7361e-0.3064t+0.9616 e-0.0392t,释药前期为快速释放相,后期为慢速释放相;rhG-CSF注射液为一级释药动力学。rhG-CSF-Lip较rhG-CSF注射液具有显著的缓释特征。维生素E作为抗氧剂加入脂质体,可显著降低脂质体的氧化指数,制得rhG-CSF脂质体氧化指数为0.10±0.02;在2～8℃的条件下放置6个月,氧化指数与0月比较未有显著性差异;采用60Co辐射灭菌,脂质体稳定。4.家兔体内药物动力学研究采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血浆中rhG-CSF含量,灵敏度高,测定范围0～4000pg/ml。家兔静脉注射rhG-CSF后,体内药物动力学符合双室模型特征,t1/2α和t1/2β分别为0.118h和1.786h;家兔静脉注射rhG-CSF脂质体后,体内药物动力学符合双室模型特征,t1/2α和t1/2β分别为0.345h和3.518h。制成rhG-CSF-Lip后,在家兔体内的消除半衰期显著延长。结论:rhG-CSF为蛋白质多肽类生物技术药物,口服给药吸收困难,理化性质不稳定,易受消化液pH、菌群、酶系统分解和破坏,稳定性差,生物利用度低;目前国内外仅有注射液应用于临床,由于rhG-CSF在体内清除快、半衰期短,使临床用药受到限制。采用前体脂质体技术,制成rhG-CSF-Lip后,可显著改变rhG-CSF在生物体内的药物动力学性质,生物半衰期t1/2β由1.786h延长至3.518h,不仅可达长效目的,且稳定性显著提高,各项指标达到设计目的和要求,可为rhG-CSF新剂型开发研究提供科学的理论依据,具有很高的科学价值和实际应用前景,该项研究,国内外尚未见报道。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 重组人粒细胞集落刺激因子脂质体含量及包封率测定方法
• 一、仪器与材料
• 二、方法与结果
• 1.重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）含量测定
• 1.1 测定方法的选择
• 1.2 测定方法
• 1.3 线性关系试验
• 1.4 精密度试验
• 1.5 方法回收率试验
• 1.6 加样回收率试验
• 2.包封率的测定
• 2.1 包封率测定方法的选择
• 2.2 Triton X-100用量的选择
• 2.3 包封率的测定
• 2.4 载药量的测定
• 三、讨论
• 第二部分 重组人粒细胞集落刺激因子脂质体制备工艺和处方研究
• 一、仪器与材料
• 二、方法与结果
• 1.处方前研究
• 1.1 重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）理化性质
• 1.2 卵磷脂溶解性能及稳定性研究
• 2.制备方法的选择
• 2.1 薄膜法
• 2.2 注入法
• 2.3 表面活性剂处理法
• 2.4 挤压法
• 2.5 钙融合法
• 2.6 逆相蒸发法
• 2.7 前体脂质体
• 3.脂质体制备工艺的研究
• 3.1 卵磷脂、胆固醇和山梨醇用量的选择
• 3.2 前体脂质体法制备rhG-CSF脂质体
• 4.脂质体的质量评价
• 4.1 形态观察、粒径与粒度分布
• 4.2 Zeta电位测定
• 4.3 脂质体氧化指数
• 4.4 pH测定
• 三、讨论
• 第三部分 重组人粒细胞集落刺激因子脂质体理化性质与稳定性研究
• 一、材料和仪器
• 二、方法与结果
• 1.体外释药动力学研究
• 2.脂质体稳定性研究
• 2.1 维生素E对脂质体稳定性的影响
• 2.2 两种灭菌工艺对脂质体稳定性的影响
• 2.3 温度对rhG-CSF脂质体的影响
• 2.4 光照对rhG-CSF脂质体的影响
• 2.5 rhG-CSF脂质体渗漏率
• 三、讨论
• 第四部分 重组人粒细胞集落刺激因子脂质体家兔药物动力学研究
• 一、仪器与材料
• 二、方法与结果
• 1.血液和各组织中rhG-CSF含量测定方法
• 1.1 血液和各组织中rhG-CSF含量测定方法的选择
• 1.2 测定原理
• 1.3 测定方法
• 1.4 家兔血浆标准曲线的建立
• 1.5 精密度试验
• 1.6 家兔血浆加样回收率试验
• 2.动物试验
• 2.1 家兔体内药物动力学试验
• 2.2 家兔体内药物动力学试验结果
• 三、讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• rhG-CSF前体脂质体的制备及体外释药动力学研究
• 顺铂前体脂质体的制备及包封率测定
• 学位论文评阅及答辩情况表