论文题目: 碱性果胶酶的发酵条件研究及酶的分离纯化
论文类型: 硕士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 张保国
导师: 张国政
关键词: 吉氏芽孢杆菌,碱性果胶酶,固体发酵,分离纯化
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 从碱性土壤中分离得到一株高产碱性果胶酶的菌株S-2,对该菌株进行形态特征和生理生化鉴定,确定其为革兰氏阳性,杆菌,有芽孢;并用16SrDNA方法分析,该菌株与吉氏芽孢杆菌DSM 8722（Bacillus gibsonii DSM 8722）的序列相似性为99%,因而鉴定其为吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）。 对吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）S-2菌株产碱性果胶酶的固态发酵条件优化表明:甜菜渣是最适碳源和酶的诱导物,酵母膏为最适氮源;最佳固体培养基的组成为:甜菜渣5g,酵母膏0.15g,Na2CO30.09g,KH2PO430mg,MgSO4·7H2O 27mg,水15mL;对吉氏芽孢杆菌（Bacillus gibsonii）S-2的培养条件进行优化的结果为:种龄为24h,接种量2ml,培养温度35℃,发酵周期48h。在此条件下产酶率为3700u/g。 对发酵后酶的提取工艺研究表明:用30倍体积的的Na2CO3/NaHCO3（pH10.5）缓冲液浸提1h,酶收率最高。该酶的最适pH为10.5,最适反应温度为60℃;酶的pH稳定性实验结果表明55℃水浴保温30min后,该酶在pH9.0—pH10.5范围内较稳定;酶的热稳定性实验结果表明:在35℃时,酶可以长时间保持活力,大于55℃时,酶的活力损失很快。金属离子Ca2+、Mg2+和表面活性剂Tween80、Tween60、Tween20、SDS对酶都有明显的激活作用。 碱性果胶酶粗酶液经微滤、超滤、硫酸铵盐析、Sephadex—G25柱层析、阴离子交换纤维素Express-ion D柱层析、Sephadex—G100柱层析,分离纯化,得到两种均一组分,分别为聚半乳糖醛酸酶和聚半乳糖醛酸裂解酶。经SDS—PAGE电泳,得出这两种酶的分子量都为41KD。
论文目录:
1 前言
1.1 碱性果胶酶在植物药提取中的应用及意义
1.2 果胶酶的作用模型、分类及性质
1.2.1 果胶质的组成和性质
1.2.2 果胶酶的作用模型和分类
1.2.3 果胶酶的性质
1.2.4 果胶酶的结构与分子生物学
1.3 微生物发酵法生产碱性果胶酶研究
1.3.1 产碱性果胶酶的菌种
1.3.2 碱性果胶酶的微生物发酵生产
1.3.3 国内外碱性果胶酶的研究
1.4 果胶酶的分离纯化方法
1.5 果胶酶的分析方法
1.5.1 透明圈法
1.5.2 果胶酯酶测定方法
1.5.3 电泳转移胶膜法
1.5.4 AJDA法
1.5.5 黏度下降法
1.5.6 还原糖测定法
1.5.7 果胶裂解酶活性分析
1.5.8 生物分析法
1.6 果胶酶的应用
1.6.1 在医药行业中的应用
1.6.2 在食品、纺织和造纸行业中的应用
1.6.3 生物技术领域的应用
1.6.4 其他应用领域
1.7 本课题研究目的和研究内容
1.7.1 研究的目的和意义
1.7.2 研究的主要内容
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 土样
2.1.2 主要仪器
2.1.3 主要试剂
2.1.4 培养基
2.1.5 主要溶液
2.2 分析方法
2.2.1 还原糖法测定聚半乳糖醛酸酶活性
2.2.2 AJDA法测定内切果胶酶活性
2.2.3 紫外吸收法测定果胶裂解酶活性
2.2.4 还原糖法测定羧甲基纤维素(CMC)酶活性
2.2.5 还原糖法测定半纤维素酶活性
2.2.6 蛋白质浓度测定(Fofin-酚法)
2.3 实验方法
2.3.1 出发菌种的筛选
2.3.2 菌种的鉴定
2.3.3 吉氏芽孢杆菌S-2液态发酵初步研究
2.3.4 吉氏芽孢杆菌S-2固态发酵条件的优化
2.3.5 果胶酶的提取工艺试验和粗酶液的特性
2.3.6 酶的分离纯化
3 结果与讨论
3.1 产碱性果胶酶活力较高的菌株的获得
3.2 菌种的鉴定
3.2.1 菌体形态特征
3.2.2. 菌落形态特征
3.2.3 生理生化特性
3.2.4 16SrDAN的序列分析
3.3 吉氏芽孢杆菌S-2液态发酵初步研究
3.4 吉氏芽孢杆菌S-2固态发酵条件研究
3.4.1 碳源种类对产碱性果胶酶的影响
3.4.2 不同氮源对碱性果胶酶酶产率的影响
3.4.3 不同酵母膏浓度碱性果胶酶酶产率的影响
3.4.4 不同糖类对碱性果胶酶酶产率的影响
3.4.5 培养基中的含水量对产酶的影响
3.4.6 Na2CO3的添加量对培养基初始pH和产酶的影响
3.4.7 KH2PO4的添加量对产酶的影响
3.4.8 不同盐类对产酶的影响
3.4.9 最佳产酶营养条件的研究
3.4.10 种龄对产酶的影响
3.4.11 接种量对产酶的影响
3.4.12 不同培养温度下产酶生长曲线
3.5 果胶酶的提取工艺试验和粗酶液的特性
3.5.1 果胶酶的提取工艺
3.5.2 粗酶液的性质
3.6 酶的分离纯化
3.6.1 粗酶液的酶谱分析
3.6.2 硫酸按盐析提纯
3.6.3 Sephadex-G25柱层析
3.6.4 阴离子交换纤维素Express-ion D柱层析
3.6.5 Sephadex-G100柱层析
3.6.6 纯度鉴定和分子量测定
4 结论
5 展望
6 参考文献
7 致谢
8 研究生期间发表论文和专利情况
发布时间: 2007-01-10
参考文献
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