ROS和丁内酯—I抑制山羊卵母细胞减数分裂的研究

论文摘要

研究证明,体外成熟卵母细胞质量远不如体内成熟卵母细胞。这主要是由于在体外卵母细胞脱离了卵泡的有机调控,很快完成核成熟而胞质成熟不充分的缘故。于是,近来人们试图通过抑制卵母细胞体外核成熟,使胞质充分成熟。ROS和BL-Ⅰ作为两种细胞周期依赖性激酶抑制剂,正广泛受到关注。虽然在牛、猪和马上ROS和BL-Ⅰ的应用很多,但在山羊上还没见报道。本实验以随机屠宰山羊卵巢为材料研究了ROS（Roscovitine）和丁内酯—Ⅰ（Butyrolactone Ⅰ,BL-Ⅰ）两种细胞周期依赖性激酶抑制剂对山羊卵母细胞减数分裂恢复的抑制作用。结果表明: 1、ROS和BL-Ⅰ能抑制山羊卵母细胞减数分裂。200μM ROS、100μM BL-Ⅰ、100μM ROS+6.25μM BL-Ⅰ和50μM ROS+25μM BL-Ⅰ抑制24h的抑制率分别为78.4%、80.9%、80.3%和77.8%。 2、抑制24h后转为正常培养24h,各处理组卵母细胞的成熟率分别为81.3%、81.9%、83.2%和85.2%,与对照组（83.0%）无显著差异。成熟卵母细胞的化学激活率分别为93.3%、96.2%、92.5%和90.5%,与对照组（97.8%）无显著差异。然而,抑制处理后卵母细胞的卵裂率和桑椹胚率降低,未能发育到囊胚。上述方案抑制山羊卵丘扩展,并且转为正常培养后卵丘不能再恢复扩展。 3、200μM ROS抑制8h,卵丘细胞可以完全恢复扩展,孤雌胚胎的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率与对照组无差异,但抑制16h转为正常成熟,卵丘细胞只能部分恢复扩展,孤雌胚胎的卵裂率不受影响,但桑椹胚率显著下降,没有囊胚产生。 4、200μM ROS抑制不同时间后山羊卵母细胞GV染色质构型不同。抑制8h山羊卵母细胞GV染色质构型以GV3n（43.4%）为主,GV3c比例（27.6%）基本不变,而GV2n和GV2c比例显著减少,但抑制24h后以GV3c（41.6%）为主,GV3n比例显著下降,而GVBD的比例显著升高。 5、抑制COCs的ROS浓度高于DOs。裸卵抑制过程中加入COCs或转为正常培养时与卵丘细胞单层共培养,均能提高抑制后裸卵的成熟能力。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 卵母细胞获能
• 1.2 体外抑制卵母细胞减数分裂恢复的方法和试剂
• 1.3 ROS和BL-I的研究
• 1.4 卵丘细胞在卵母细胞体外成熟过程中的作用
• 1.5 卵母细胞生发泡（GV）染色质构型
• 1.6 本文主要的研究内容
• 2 材料方法
• 2.1 卵母细胞的获取
• 2.2 卵母细胞培养
• 2.3 卵母细胞的孤雌激活
• 2.4 孤雌激活胚胎的体外培养
• 2.5 卵母细胞核形态的判定
• 2.6 卵母细胞GV染色质构型的观察
• 2.7 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 BL-I和ROS抑制山羊卵母细胞减数分裂的最适浓度
• 3.2 解除抑制转为正常培养后山羊卵母细胞的成熟和激活情况
• 3.3 解除抑制后成熟卵母细胞孤雌胚胎的体外发育
• 3.4 ROS抑制不同时间转为正常培养后卵母细胞的成熟、激活和发育情况
• 3.5 ROS抑制不同时间对山羊卵母细胞GV染色质构型的影响
• 3.6 ROS对山羊裸卵（DOs）的抑制
• 3.7 不同浓度ROS对山羊DOs的抑制作用
• 3.8 抑制过程中和抑制后转为正常成熟过程中卵丘细胞对山羊DOs成熟的作用
• 3.9 抑制培养液中添加PMSG对COCs和DOs抑制的影响
• 3.10 正常成熟核进程和抑制后放开成熟过程中核进程
• 3.11 对照和抑制后放开卵母细胞体外核成熟各时相出现的时间
• 3.12 ROS对小卵泡卵母细胞减数分裂恢复的抑制及抑制后卵母细胞的成熟、激活和发育（卵泡直径为0.8—1.2mm）
• 3.13 ROS抑制不同时间后山羊小卵泡卵母细胞GV染色质构型（卵泡直径0.8—1.2mm）
• 4 讨论
• 4.1 ROS和BL-I的有效作用浓度
• 4.2 抑制24h降低山羊卵母细胞早期发育能力
• 4.3 缩短抑制时间能提高卵母细胞的发育能力和卵丘扩展能力
• 4.4 抑制后卵母细胞的GV染色质构型
• 4.5 对裸卵的抑制
• 4.6 抑制后核进程加快
• 4.7 抑制可以增加山羊小卵泡卵母细胞的成熟和发育能力
• 5 结论
• 参考文献
• 图版及图版说明
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况