黄孢原毛平革菌胞外低分子物质在木素降解过程中作用的研究

论文摘要

木素是自然界中含量最丰富的可再生性有机资源之一，其生物降解构成自然界碳素循环的限速步骤。真菌中的白腐菌类具有完整的木素降解体系，能将木素彻底氧化性降解为CO2和H2O。黄孢原毛平革菌（Phanerochete chrysosporium）作为一模式菌株，得到深入研究。木素过氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）就是最早从此菌中发现的，并由此作为一个新的起点，推动了白腐菌酶学领域的深入发展。但由于木素结构复杂，至今其生物降解机制仍未阐明，各类木素降解酶在胞外都难以实现对天然木素的彻底降解；免疫标记研究证明，LiP和MnP等大分子酶蛋白并不能直接穿过完整木材的微孔结构，进入细胞壁以启动木素的降解。这些研究对已发现的木素降解酶在天然木素降解中的作用提出了疑问，并启发人们推测可能有多种低分子活性物质和木素降解酶协同参与木素生物降解，因而活性低分子物质在木素、纤维素降解中的作用成为一个新的研究热点。目前发现的参与木素降解的低分子物质除O2和H2O2外，主要有羟基自由基／铁离子、活性氧基（reactive oxygen species，ROS）、藜芦醇（veratryl alcohol，VA）、草酸等小分子有机酸／锰离子、3-羟基邻氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid，3-HAA）等，但迄今为止，关于它们在木素生物降解过程中的作用都是推测。 早在1996年，本实验室即发现木霉中的低分子肽类具有氧化性降解纤维素的能力，此后由褐腐真菌中分离纯化到具有类似功能的小肽Gt factor，本研究工作是上述工作的深入。本论文以P．chrysosprium胞外培养液中分子量5000 Da以下的低分子系统为研究对象，细致而全面地考察了P．chrysosprium胞外低分子系统的性质，通过一系列分离纯化步骤，从其中获得三种新型低分子量物质，分别命名为Pc factor（Pc因子）、Pc reducer（Pc还原因子）和MnP promoter（MnP促进因子）。这三种低分子物质功能各具特色，Pc factor具有酚氧化活性，Pc reducer具有还原某些自由基的性质，MnP promoter则具有促进MnP活力的功能，采用紫外可见光谱（UV-Vis）、红外光谱（FT-IR）、质谱（MS）、核磁共振（NMR）、电子自旋共振（ESR）等方法探索了其结构与性质，研究了它们在木素生物降解中的作用，并进一步做了组建胞外可

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文中的缩写词表
• 第一章 研究背景
• 1.1 木素的概述
• 1.2 降解木素的微生物及其生物学特点
• 1.3 木素降解酶的酶学特性及其分子生物学
• 1.4 木腐真菌中活性低分子物质的研究
• 1.5 论文的立题依据、可行性分析和主要研究内容
• 第二章 P.chrysosporium产生的具有氧化性活力低分子肽类物质的分离纯化与性质鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 Pc factor与MnP氧化2,6-DMP的动力学比较
• 2.2.2 分离纯化
• 2.2.3 结构特点
• 2.2.4 催化特点
• 3+和还原Fe³⁺能力'>2.2.5 络合Fe³⁺和还原Fe³⁺能力
• 2+的能力'>2.2.6 络合Fe²⁺的能力
• 2.2.7 金属离子和EDTA对氧化活力的影响
• 2.2.8 反应体系中氧分压对氧化活力的影响
• ·产生'>2.2.9 TBA法和KTBA法检测HO^·产生
• 2.2.10 底物作用范围
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第三章 P.chrysosprium产生的具有还原性质低分子物质的分离纯化与性质鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 分离纯化
• 3.2.2 结构特点
• 3.2.3 还原特性的验证
• 3.2.3.1 对羟基自由基自旋加合物的还原
• 3.2.3.2 对稳定氮氧自由基4-maleimideo-TEMPO的作用
• 3.2.3.3 对木素中稳定自由基的作用
• 3.2.4 对LiP和MnP活力的影响
• 3.2.5 Pc reducer抑制过氧化物酶氧化酚类物质引起的聚合反应
• 3.2.6 稳定性
• 3+和还原Fe³⁺能力'>3.2.7 络合Fe³⁺和还原Fe³⁺能力
• ·产生'>3.2.8 TBA法和KTBA法检测HO^·产生
• 3.3 讨论
• 3.4 结论
• 第四章 体外组建可持续性木素氧化降解体系的初探
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 原始胞外低分子体系氧化2,6-DMP能力
• 4.2.2 Pc factor和Pc reducer的比例对氧化性能的影响
• +、NADP⁺对体系氧化性能的影响'>4.2.3 NADH、NADPH、NAD⁺、NADP⁺对体系氧化性能的影响
• 4.2.4 MnP、SHP过氧化物酶和纤维素酶对体系氧化性能的影响
• -离子对体系氧化性能的影响'>4.2.5 CN^-离子对体系氧化性能的影响
• 4.3 结论
• 第五章 P.chrysosporium产生的具有促进MnP活力的低分子物质的分离纯化与性质鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 分离纯化
• 5.2.2 结构特点
• 5.2.3 MnP promoter对MnP活力的促进
• 5.2.3.1 在酒石酸缓冲体系中检测促进MnP活力
• 5.2.3.2 在醋酸缓冲体系中促进MnP活力
• 5.2.3.3 MnP promoter与MnP活力的量效关系
• 5.2.3.4 能否扩大MnP的底物作用范围
• 3+和还原Fe³⁺能力'>5.2.4 络合Fe³⁺和还原Fe³⁺能力
• ·产生'>5.2.5 TBA法检测HO^·产生
• 5.3 讨论
• 5.4 结论
• 第六章 P.chrysosporium产生的低分子物质在木素降解中作用
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 对水溶性木素磺酸盐分子量分布的影响
• 6.2.2 处理木素前后结构的变化
• 6.2.2.1 木素溶出物的紫外光谱分析
• 6.2.2.2 还原差示紫外光谱法测定木素样品羰基含量
• 6.2.2.3 离子差示紫外光谱法测定木素样品酚羟基含量
• 6.2.2.4 经低分子组分和酶处理后二氧六环木素的红外光谱分析
• 1H-NMR分析'>6.2.2.5 经低分子组分和酶处理后二氧六环木素的¹H-NMR分析
• 6.3 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 主要发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表