二膦酸盐对人骨肉瘤细胞株MG-63细胞生长及OPG/RANKL表达影响的实验研究

论文摘要

目的:体外实验观察二膦酸盐对骨肉瘤MG-63细胞抑制增殖、诱导凋亡,探讨在一定时间范围内,二膦酸盐诱导体外培养的人骨肉瘤细胞凋亡的最适作用浓度。分析二膦酸盐对细胞内骨保护素OPG、RANKL在基因和蛋白水平表达上的影响,初步探讨二膦酸盐对人骨肉瘤MG-63细胞作用可能机制。方法:1.将浓度分别为0.3、1、3、10、30、100、300、1000μmol/L二膦酸盐药物干预人骨肉瘤细胞株MG-63作用24h、48h、72h,采用MTT比色法测定其细胞活力,绘制细胞生长曲线,并计算药物半数抑制浓度;2.形态学观察:荧光染色法,采用Hoechst33258细胞染色法观察二膦酸盐药物干预后的骨肉瘤细胞,在荧光显微镜下观察早期、晚期凋亡细胞的形态。透射电镜下观察作用后早、晚期凋亡细胞,细胞凋亡超微结构形态;3.采用碘化丙啶（PI）染色药物作用后的骨肉瘤细胞,流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡比例及细胞周期,FCM进行细胞周期分析及凋亡率检测;4.采用RT-PCR和Western blotting方法检测OPG、RANKL在mRNA水平和蛋白水平的变化。结果:1.二膦酸盐药物作用于人骨肉瘤细胞株24h、48h、72h后,细胞生长明显受抑制,生长抑制曲线表现为上升趋势,与对照组比较统计学上有显著性差异。肿瘤细胞生长抑制率呈现药物浓度和时间依赖性。MTT比色法测得药物作用72h对MG-63细胞的ID50为52.37±1.0μmol/L,实验组与对照组t检验分析t=2.201,P＜0.01;2.二膦酸盐浓度为50μmol/L作用于骨肉瘤细胞株72h后,经Hoechst33258细胞染色荧光显微镜下可见早期凋亡细胞,随着作用浓度和时间增加,早期凋亡细胞数量增加,并出现晚期凋亡细胞,透射电镜证实其对细胞凋亡超微结构改变;3.细胞周期分析二膦酸盐对G1期细胞阻滞,实验组G2/M期细胞比例（7.13±0.91）%,相比对照组（32.15±2.31）%,P＜0.01有统计学意义;二膦酸盐50μmol/L作用24、48、72h的MG-63细胞,经Annexin V-FITC/PI双标记染色72h后细胞凋亡率（40.2±2.1）%相比对照组细胞（2.8±0.7）%有统计学意义,P＜0.01;4.RT-PCR产物扩增出条带位置,与预期条带一致。在486bp大小片段处RANKL表达的实验组与对照组无明显差异;相反OPG的表达与对照组相比明显增加,经光密度分析,OPG表达增加是对照组1.8倍;Western印迹检测结果示,当二膦酸盐浓度为0.1～10μmol/L时印迹有明显条带,蛋白表达逐步上调,经光密度分析,实验组随着药物浓度增加OPG蛋白表达上调。结论:1.二膦酸盐对体外培养骨肉瘤MG-63细胞增殖数量与药物浓度及时间有显著依赖性;2.体外实验研究表明二膦酸盐可明显诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡,抑制细胞生长,细胞阻滞在G1期;3.体外实验探索了二膦酸盐对骨肉瘤细胞内OPG、RANKL表达影响,发现其在mRNA水平和蛋白水平上调OPG表达。

论文目录

• 目录
• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 实验材料
• 2.1 细胞株
• 2.2 试剂
• 2.3 仪器与设备
• 3 实验方法
• 3.1 细胞的培养与传代
• 3.2 细胞活力测定实验
• 3.3 MTT法细胞增殖抑制实验
• 3.4 细胞荧光染色法
• 3.5 透射电子显微镜观察凋亡细胞形态
• 3.6 细胞周期和DNA倍体分析
• 3.7 Annexin V-FITC检测细胞凋亡
• 3.8 RT-PCR法半定量检测OPG、RANKL mRNA表达
• 3.9 Western blotting检测OPG蛋白表达
• 3.10 统计学分析
• 4 结果
• 4.1 MTT法细胞增殖活力检测
• 4.2 荧光显微镜观察
• 4.3 电镜观察
• 4.4 流式细胞仪凋亡细胞检测
• 4.5 流式细胞仪细胞周期检测
• 4.6 OPG、RANKL mRNA表达半定量测定
• 4.7 二膦酸盐对OPG蛋白表达影响
• 5 讨论
• 6 结论
• 6.1 二膦酸盐对骨肉瘤细胞株MG-63有抑制增殖作用
• 6.2 二膦酸盐对骨肉瘤细胞株MG-63有促进凋亡作用
• 6.3二膦酸盐影响骨肉瘤细胞内OPG的表达上调
• 7 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述:二膦酸盐的细胞分子机制研究进展