转染VEGF165基因的内皮祖细胞移植治疗慢性深静脉血栓的实验研究

论文摘要

目的:研究细胞移植与基因转染对慢性深静脉血栓的协同治疗作用,为慢性深静脉血栓的治疗提供一种新的治疗思路。方法:首先用pAdEasy系统构建携有血管内皮生长因子165（VEGF165）的重组腺病毒载体。HEK293A细胞包装、重组、扩增腺病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。PCR、双酶切、基因测序进行鉴定。同时用Ficoll法分离大鼠骨髓单个核细胞,EBM-2MV培养基培养扩增骨髓源性EPCs并进行鉴定。MTT法描绘生长曲线。再用Ad-VEGF165体外转染EPCs,荧光显微镜观察绿色荧光表达,激光共聚焦测转染效率,MTT法测对生长活性的影响,ELISA检测上清中VEGF的表达。转染后行Dil体外标记EPCs。然后结扎大鼠肾下段下腔静脉建立慢性深静脉血栓模型,分四组:A组（n=25只）,基因转染的EPCs移植组,移植1ml含有106个带有VEGF165的EPCs细胞悬液;B组(（n=25只）,单纯EPCs组,移植1ml含有个106EPCs细胞悬液;C组(（n=25只）,转染空病毒的EPCs组,移植1ml含有106个转染空病毒的EPCs细胞悬液;D组(（n=25只）,空白对照组,移植1ml培养基。移植后分时间段取出血栓段下腔静脉及血栓,应用实时荧光定量PCR技术检测VEGF、ANG-1 mRNA的表达变化,同时应用western blot测下腔静脉及血栓内VEGF、ANG-1蛋白表达变化;HE染色及vWF免疫组化染色观察血栓机化再通情况,扫描电镜观察血栓中新生血管通道。高倍显微镜下计数血栓再通毛细血管密度。采用SPSS11.5软件进行分析,P<0.05,有统计学意义。结果:成功构建了Ad-VEGF165,成功培养了大鼠骨髓源性内皮祖细胞。Ad-VEGF165能有效转染EPCs,合适比率的转染对EPCs生长具有促进作用,转染后的EPCs能高分泌VEGF蛋白。移植后通过标记观察EPCs在体内存活并分化为内皮细胞。EPCs移植后,A、B、C、D四组VEGF、ANG-1 mRNA均有表达,A组较B、C、D组明显上调（P<0.05）,B、C组较D组明显上调（P<0.05）,B组和C组之间无统计学意义（P>0.05）。移植后四组血栓再通毛细血管密度A组明显高于B、C组（P<0.05）及D组（P<0.01）,B、C组之间无统计学意义,B、C组明显高于D组（P<0.05）,有统计学意义。免疫组化染色vWF确定再通管道为新生血管,管道为内皮细胞组成。结论: Ad-VEGF165能成功转染EPCs,合适比率的转染能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力明显增强,显著加快血栓机化再通。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 技术路线略图
• 引言
• 第一部分 血管内皮生长因子165 重组腺病毒（Ad-VEGF165）的构建
• 材 料
• 方法
• 讨论
• 第二部分 大鼠骨髓源性内皮祖细胞的培养及鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 Ad-VEGF165 体外转染内皮祖细胞的实验研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 Ad-VEGF165 转染内皮祖细胞移植治疗慢性深静脉血栓的体内研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 附图
• 综述
• 缩略词表
• 致谢
• 详细摘要