慢病毒介导的RNAi抑制小鼠血管内皮细胞α1，3GT表达的研究

论文摘要

目的:应用RNAi（RNA interference）技术探讨靶向α1,3半乳糖基转移酶（α1,3GT）的shRNA重组慢病毒载体抑制小鼠血管内皮细胞α1,3GT和α1,3半乳糖残基Galα（1,3）Gal表达的可行性。方法:采用组织植块法体外培养小鼠血管内皮细胞;经体外设计合成针对α1,3GTmRNA的序列特异性shRNA,并构建携带α1,3GT shRNA的重组慢病毒载体,以慢病毒感染小鼠血管瘤内皮细胞系EOMA;荧光实时定量PCR检测转染后α1,3GT mRNA表达水平的变化,免疫荧光检测异种抗原Galα（1,3）Gal表达水平的变化;使用SPSS 13.0 for Windows进行数据分析。结果:体外组织植块培养可获得纯度较高的小鼠血管内皮细胞;成功构建了重组慢病毒载体质粒。经病毒包装后,得到了携带α1,3GT-shRNA的成熟的重组慢病毒颗粒;荧光实时定量PCR检测显示构建的重组慢病毒转染EOMA,能抑制α1,3GT的表达,抑制率约为88%（P＜0.01）。空病毒载体对照组、阴性siRNA对照组与未处理细胞组的mRNA转录水平无显著性差异（P＞0.05）;免疫荧光检测显示α1,3GT-shRNA重组慢病毒转染后细胞Galα（1,3）Gal抗原水平较对照组明显降低（P＜0.01）,空病毒载体对照组、阴性siRNA对照组与未处理细胞组间的Galα（1,3）Gal抗原表达无显著性差异（P＞0.05）。结论:通过组织植块法可实现小鼠血管内皮细胞的原代培养并传代,但传代的次数有限;本实验成功构建了靶向α1,3GT基因的重组慢病毒载体,并利用该慢病毒载体成功地将α1,3GT-shRNA表达框架转导入EOMA细胞,使其持续表达,实现了靶向α1,3GT基因的RNA干扰。重组慢病毒载体有效地抑制了α1,3GTmRNA,并且抑制了其所催化的蛋白Galα（1,3）Gal的表达。通过实验,初步说明慢病毒载体介导的RNAi技术对沉默α1,3GT基因从而下调异种抗原Galα（1,3）Gal表达的策略是可行的。从而为进一步研究利用RNAi技术减轻异种移植超急性排斥反应提供了实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、小鼠血管内皮细胞的原代培养
• 1 对象和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 二、靶向小鼠α1,3GT-shRNA慢病毒载体的构建
• 1 对象和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 三、慢病毒介导的shRNA对EOMA细胞中α1,3GT和Gal α（1,3）Gal的抑制作用
• 1 对象和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 异种移植排斥反应及其对策研究进展
• 综述参考文献
• 致谢