论文摘要
(Ⅰ)衰老是植物的自然规律，但在合理的生育期的前提下适当延缓衰老，延长叶片的功能期，提高光合作用，可以协调作物的源库关系，保证品种产量潜力的充分发挥。本研究把来源于豌豆的通过控制叶绿体发育影响植物发育进程的PPF1基因导入水稻，以期获得衰老延缓的转基因水稻。同时，本文从菌株互作及菌株状态、脱菌培养、干燥培养、分化和移栽等因素入手对农杆菌转化水稻过程中的诸多影响因素进行了探讨。归纳如下：1．利用农杆菌介导法，把短日豌豆花后特异表达、具有延缓衰老作用的基因PPF1转入水稻。约970块未成熟胚性愈伤组织与农杆菌共培养后，得到了约280块抗性愈伤，从中分化出抗性绿苗54株。2．PCR、Southern blotting检测结果表明外源基因已经插入受体基因组，其中42株含有目的基因，阳性率为77.7％。部分阳性植株的叶绿素含量和光合指标分析表明，多数转基因植株明显高于对照。3．在T3代转基因植株中发现一个叶片衰老进程显著受到抑制的转基因株系line 269。PCR、Southern blotting分析发现该株系为一个单位点插入系，PPF1基因位点在转基因株系内已经纯合，并能够作为单个孟德尔因子在水稻中遗传。RT-PCR分析结果显示PPF1基因能够在该株系内稳定表达。生理指标测定证实上三叶叶绿素含量、净光合速率和气孔导度均较对照显著提高。4．两个独立时期的叶色观察表明，该株系同位叶的叶色明显较对照青绿，对应叶片的衰老值差异均在1左右，显示出源足的高光效特征。同时，转基因株系的穗重、千粒重、单株产量均较对照有显著的提高，结实率提高达极显著水平。这些结果证实PPF1基因在转基因纯系中的表达使植株衰老延缓。作为结果，转基因植株的产量在一定程度上得到了提高。5．以3个籼稻和2个粳稻品种为对象，对农杆菌转化水稻过程中影响转化效率的因素进行了研究。结果表明，AGL1和EHA105按一定比例混合共转化和转化前菌体重悬对抗性愈伤率有显著影响；琼脂粉加倍和超净工作台上风干4h能明显提高抗性愈伤率和分化率；分化培养基中加入二甲基桠枫（DMSO）或脯氨酸（pro）可以提高分化率；壮苗时加入适量的NAA有利于壮根并提高移栽成活率。应用此农杆菌转化系统，获得了一批经PCR和点杂交鉴定的转基因植株。（Ⅱ）植物的生殖生长是非常重要的发育过程，此阶段的任何异常都可能导致植物的繁衍障碍。而对于水稻这种以子实作为主要的收获器官的作物来讲，生殖生长显得尤为重要。根据被子植物生殖胚胎学，植物的生殖异常可以归结为雄性不育、雌性不育或雌雄不育等几种原因，此外，花器官的异常发育也是造成植物结实异常的重要原因。近年来，科学家们已经发现和鉴定了很多的生殖相关突变体或基因，部分生殖发育相关机制也在逐渐明朗。但是，还有很多的有关生殖发育分子机理还知之甚少，而这些机理的深入探讨有待于更多突变体的发掘和研究。本文对几个来自于籼稻的生殖发育突变体进行了形态鉴定、解剖观察、细胞观察和遗传分析等，以期认识突变性状的特性及原因。同时利用SSR标记结合群分法对部分突变基因进行了染色体定位，希望为水稻的生殖生物学的深入研究奠定基础。1．利用一个从籼型恢复系蜀恢202中发现的自然不育突变株作为材料，通过形态鉴定、正反杂交、胚囊细胞观察和传粉生物学鉴定，初步确定了该突变体的类型和突变产生的直接原因。同时，以该突变性状的遗传特性进行了分析，并利用网上公布的SSR系列引物和相关基因组序列，对该基因进行了精细的染色体定位。主要结果如下：1)突变体自然结实率为2.9％，最高不超过5％；当以突变体为母本分别与202R、9311、D62B、527R、881R等杂交时，不能得到杂交种子，即便几种花粉混合授粉，其结实率也仍然为零；然而，反交平均结实率为36.7％。解剖观察发现，突变体和野生型小花之间没有发现显著的差异；碘染镜检显示突变体的花粉在外型和染色深度上与野生型接近，可育率均在85.7％左右。表明该突变体是一个雌性器官特异性的不育突变体，该突变并不影响雄配子体的功能。2)成熟胚囊观察结果显示，90％以上的突变体成熟胚囊具有完整的内部结构。卵器数目正常、极性明显、位置正常，呈现典型的蓼型结构，雌雄器官的发育是同步。但是，我们未能观察到精细胞进入胚囊以及胚和胚乳的形成、发育。相反，我们发现了未经受精作用的卵细胞的解体。这些结果提示突变体的败育可能发生在受粉阶段。3)荧光显微观察发现突变体花粉粒在开花后3-5分钟即开始萌发，随即开始进入柱头。20分钟时，突变体的花粉管在花柱中的延伸速度明显低于野生型。随后，突变体花粉管在花柱疏导组织中的生长却被异常地阻断。具体的几种畸形可以归纳如下：A，花粉管顶端气泡状彭大；B，花粉管顶端弯曲，逆向生长；C，顶端凝聚，扭曲生长；D，花粉管顶端分叉，停止生长。由此表明该突变体是由于花粉管在花柱疏导组织中生长受阻、不能完成正常的双受精过程而最终导致不育。4)多个组合的杂种F1全部表现正常可育，F2群体出现育性分离，且可育株与不育株的比例均符合3：1的分离比，回交群体均基本符合1：1的分离比，表明该雌不育性状为一对基因控制的隐性突变。由于此类基因尚属首次报道，将该基因暂时命名为Pollen TubeBlocked Female Sterility（PTBFS（t））。5)首先选用圭630×fs-202R的F2群体作为作图群体对该基因进行定位。差异标记连锁分析发现位于第5染色体短臂上的SSR标记RM153、RM122、RM13、RM413、RM592、RM405、RM437、RM169、和RM289与突变性状存在连锁关系，遗传距离分别为28、26、1.5、1.5、0、3.1、8.9、27.9、32.1CM。因此，PTBFS（t）基因被首先定位在标记RM413和RM405之间，遗传距离为4.8 CM，且与RM592表现共分离。RM413和RM405之间的物理距离在日本晴数据上为890K。利用公布的水稻基因组序列，在此区域内设计开发SSR和InDels标记，并利用扩大的F2群体进行连锁分析，进一步把基因定位在RL85和RL167之间，其间的物理距离为130K。同时，我们在组合9311×fs-202R（隐性单株310株）和多1×fs-202R F2（隐性单株106株）中进行定位分析。3个群体定位结果整合，我们成功地把PTBFS（t）基因整合在标记RL33和RD19之间，其间的物理距离为72K。同时在此区域内，标记RL60、RD2、RD1与不育基因表现共分离。6)采用TIGR Rice Browse引擎，以日本晴数据为参照，对上述定位的区段进行了基因预测，检索到10个TIGR Rice Loci。经TIGR Rice Transcript Assemblies，Rice FL-cDNA和多种微阵列探针电子杂交以及对蛋白数据库的相似性搜索，可以证实此10个预测位点为具备转录、表达特性的基因。同时发现3个基因LOCOs05g05270，LOCOs05g05320和LOCOs05g05340和数据库中可能参与传粉受精过程的EST或蛋白具有一定同源性。据此我们把此3个基因作为初步的候选基因，并对其结构和功能作了初步预测。2．利用一个来源于农家品种自然突变的花器官突变体进行了解剖观察、扫描电镜观察、遗传分析，同时对它和以前报道的相关突变体可能关系进行了分析，主要结果如下：1)突变体表现为内外孵变长，顶端不抱合，中间着生1-2朵小花，雄蕊和雌蕊的数目异常，内外孵间着生1-6个孵片类似物，结实率下降，其中约有3.5％的小花着生2粒种子。结合前人研究，我们把它命名为SRS2。2)解剖观察发现，约有60％的突变体颖花的内外孵之间含有2朵未完全发育的小花。其中，浆片转化成的孵片类似物作为两朵畸形小花的间隔；小花的雄蕊不同程度地减少，雌蕊增加，有的发现有一团雌蕊抱合的现象。约有40％颖花含有一朵不完全小花和数片互生或邻生的孵片类似物。花期碘染结果显示突变体花粉可育率为67.6％，与野生型（92.3％）相比明显下降。3) SRS2突变体的花器官分化过程按最终产生一朵或两朵小花而明显区别。前者在分化早期整个颖花原基呈现三角形不规则发育，而此时产生双花的颖花原基则半边收缩。雌雄蕊分化中期，单花突变体开始不规则的出现雄蕊原基和心皮，并在雌蕊原基周围靠近外孵一侧产生一至数枚浆片；此期间的双花突变体则从中部产生缢痕，开始不均等分裂，形成一大一小的两个颖花原基。中间的缢痕继续收缩分裂，逐渐形成间隔两花的孵片类似物。与此同时，分隔的两花原基逐渐出现雌雄蕊原基的分化。4)多个F2群体和回交群体的突变性状遗传分析显示，所有的F1均表现正常，F2群体突变性状发生分离，且均符合3：1的分离比例，而回交群体均基本符合1：1的分离比例，表明该突变性状为一对基因控制的隐性突变。3．对一个从籼稻杂交组合的后代中发现的一例雄性核不育材料进行了初步的鉴定、遗传分析和分子标记定位，主要结果如下：1)突变体植株株高降低，叶色浓绿，自然结实率在10％左右，套袋结实率为0。小花的解剖观察发现，突变体小花花丝细长，花药干瘪，呈白色且透明，但雄性器官的数量和雌性器官正常。碘染证实，突变体的花药壁内没有花粉粒着色，因此被认为是一个典型的无花粉型雄性不育材料，并命名为ms-np（male sterility with no pollens）。2)突变性状在各种背景下的分离结果表明，所有群体的F1植株均表现正常可育，F2或BC1F1出现育性分离，说明该育性基因受核基因控制而不受胞质基因组的影响，可育相对不育为显性。在所有F2群体中，育性分离均符合3：1的分离比例，而BC1F1植株则符合1：1的分离规律，表明该不育性状实为单个基因控制的隐性突变。3) SSR引物分析发现位于第6染色体上的SSR标记RM3、RM541和RM343与突变性状存在连锁关系，遗传距离分别为15.2、15.2和7.9CM。其中RM3和RM541表现共分离，与RM343分别位于突变基因的两侧。即是说，ms-np（t）基因被初步定位在水稻第6染色体上的微卫星标记RM541和RM343之间。
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