多次传代和致细胞病变猪瘟E2基因序列分析及病变细胞中DI颗粒的检测

论文摘要

本文利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）技术,对多次动物传代和致血管内皮细胞病变的猪瘟病毒石门株E2 基因的核苷酸序列进行了测定,并与标准石门株的核苷酸及氨基酸序列的同源性进行比较及分析,以期了解猪瘟主要保护性抗原E2基因的变异情况,为猪瘟的防制提供分子流行病学方面的资料。同时用猪瘟病毒石门株脾毒接种分离培养的猪脐静脉血管内皮细胞,在引起细胞病变后,用Northern杂交技术对病变细胞中有无病毒DI 颗粒的存在进行检测,对猪瘟病毒石门株致猪血管内皮细胞病变的机制进行探讨。主要试验和结果如下: （1）采用RT-PCR 和nPCR技术扩增出经猪体多次传代猪瘟病毒石门株脾毒E2 基因,将其克隆于pMD18-T 载体并进行核苷酸序列测定,用DNA star 软件比较分析脾毒E2基因与标准石门株的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现, 脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸序列同源性为99.0%,通过对主要抗原区域氨基酸位点变异进行分析,发现E2 基因抗原决定簇未发生明显的变异。（2）用猪瘟脾毒接种猪血管内皮细胞,对引起细胞病变的细胞毒E2 基因进行克隆测序,比较分析细胞毒E2 基因与标准石门株的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现, 细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98.3%,氨基酸同源性为96.7%,通过对主要抗原区域氨基酸位点变异进行分析,发现E2 基因的变异也比较小,但发现细胞毒E2基因较多次传代脾毒的变异大,说明猪瘟病毒在猪体比组织培养的遗传稳定性高。（3）根据资料,设计引物扩增出猪瘟病毒p80 基因,用地高辛随机引物标记和检测试剂盒标记该扩增产物,以此作为探针;用猪瘟脾毒接种猪血管内皮细胞,在引起细胞病变的36h、54h、72h 提取细胞总RNA,用甲醛变性凝胶电泳对总RNA 进行分离,再转至尼龙膜,用标记的探针进行Northern 杂交。结果显示,在病变的内皮细胞总RNA中没有缺失的基因组存在,所以可以推论出CSFV 石门株感染猪血管内皮细胞后在短时间的致细胞病变过程中并无DI 颗粒的产生。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一章 猪瘟病毒的病原学特性
• 1.1 猪瘟病毒的形态及理化特性
• 1.2 猪瘟病毒的基因组结构及研究进展
• 1.3 猪瘟病毒的编码蛋白、抗原性及其功能
• 1.3.1 猪瘟病毒的结构蛋白
• 1.3.2 猪瘟病毒的非结构蛋白
• 1.4 猪瘟病毒的进化和遗传分型
• 第二章 猪瘟病毒致病机制及防制
• 2.1 猪瘟的临床症状
• 2.2 猪瘟病毒对免疫系统的影响
• 2.2.1 CSFV 感染对外周血细胞亚群的影响
• 2.2.2 CSFV 诱导的白细胞减少的机制
• 2.2.3 CSFV 感染的靶细胞
• 2.2.4 单核巨噬细胞在CSFV 感染中的作用
• 2.2.5 颗粒白细胞在CSFV 感染中的影响
• 2.2.6 CTL 在CSFV 感染中的作用
• 2.3 猪瘟病毒致宿主细胞病变的遗传机制
• 2.3.1 猪瘟病毒的入侵及增殖
• 2.3.2 猪瘟病毒对宿主细胞的致病机理
• 2.4 猪瘟的防制
• 试验研究
• 第三章多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2 基因序列分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 猪瘟脾毒
• 3.1.2 猪瘟细胞毒
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 引物的设计与合成
• 3.2.2 RNA 提取
• 3.2.3 RT-PCR 和nPCR
• 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3.2.5 纯化回收DNA片段
• 3.2.6 纯化产物与PMD18-T Vector 连接
• 3.2.7 新鲜感受态细胞的制备
• 3.2.8 连接产物的转化
• 3.2.9 重组质粒的提取
• 3.2.10 重组质粒的鉴定
• 3.3 结果
• 3.3.1 目的基因的扩增及鉴定
• 3.3.2 目的基因的核苷酸序列及对应的氨基酸序列比较
• 3.4 讨论与结论
• 3.5 小结
• 第四章 猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变后DI 颗粒的检测
• 4.1 材料
• 4.1.1 猪瘟脾毒
• 4.1.2 样品RNA
• 4.1.3 试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 样品RNA的制备
• 4.2.1.1 总RNA 提取
• 4.2.1.2 总RNA 的质量鉴定
• 4.2.1.2.1 紫外分光光度仪检测
• 4.2.1.2.2 甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA 质量
• 4.2.1.3 样品RNA 的转移
• 4.2.1.3.1 转移胶的制备
• 4.2.1.3.2 转移膜的准备
• 4.2.1.3.3 转移系统的安装和RNA 的转移
• 4.2.1.3.4 RNA 在尼龙膜上的固定
• 4.2.2 探针制备
• 4.2.2.1 引物设计
• 4.2.2.2 RT-PCR 和nPCR
• 4.2.2.3 探针标记
• 4.2.2.4 探针浓度的确定
• 4.2.3 Northern杂交
• 4.2.3.1 杂交过程
• 4.2.3.2 BCIP/NBT 显色法检测杂交结果
• 4.3 结果
• 4.3.1 RNA 质量鉴定结果
• 4.3.2 p80 基因扩增结果
• 4.3.3 标记探针并选择杂交探针的浓度结果
• 4.3.4 Northern杂交结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结 论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 个人简介