金银花ISSR分子标记

论文摘要

金银花是名贵的中药材之一,有着十分重要的开发利用价值。但金银花优良品种较少,各地栽培品种混杂,分类不清,对金银花种质资源的遗传关系缺乏全面的了解,严重影响金银花新品种的推广及整个产业的良性发展,也制约了金银花良种选育的研究进程。本文以湖南、山东、河南等金银花主产区的主栽品种为试验材料,用简单重复序列间区标记（ISSR）分析技术,开展金银花分子生物学研究,探讨金银花品种间的遗传多样性,为金银花品种鉴定、种质资源的保护和利用提供理论依据。研究结果如下：以灰毡毛忍冬新品种—金翠蕾为试验材料,比较分析了SDS法、CTAB法、改良CTAB法对金银花总DNA提取的效果。结果表明：利用以上3种方法均能提取出完整的金银花基因组DNA,而DNA提取量从大到小依次为SDS法、改良CTAB法、CTAB法,DNA纯度依次为CTAB法、改良CTAB法、SDS法。综合比较,CTAB法是金银花DNA提取的适宜方法。通过单因子试验,建立了金银花ISSR-PCR反应的最佳条件：20μL反应体系中,1×PCR反应缓冲液（Mg2+ free）,1.5U Taq DNA聚合酶,0.15mmol/L dNTPs,0.4μmol/L引物,1.5 mmol/L MgCl2,60ng模板DNA。反应程序为：94°C预变性5 min；94°C变性30s,49.9°C退火30 s,72°C延伸1.5 min,35个循环；72°C延伸7min；4°C保存。从100个ISSR引物中筛选出了10个扩增条带清晰稳定、多态性高的引物。这10个引物中有8个为二核苷酸重复,所占比例为80%,其中（AC）。和（CA）。最多,占60%,且产生的多态性条带也最多,说明金银花基因组DNA中含有丰富的TG/GT重复序列。对全部22个样品扩增共得到108条带,平均每个引物扩增出10.8条带,多态性条带比例为88.9%,能充分揭示不同试验材料间的遗传多样性。22个金银花品种间的遗传相似性系数范围在0.41-1.00,平均相似性系数为0.71。金银花品种资源系统树状聚类图充分反映了22个金银花品种个体间的关系,而主坐标聚类图直观的体现了两个金银花群体之间的的遗传关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 2 文献综述
• 2.1 金银花种质资源研究进展
• 2.2 分子标记技术研究进展
• 2.2.1 分子标记的特点
• 2.2.2 分子标记的类型
• 2.2.3 几种分子标记的比较
• 2.3 ISSR分子标记技术的研究进展
• 2.3.1 ISSR技术的原理
• 2.3.2 ISSR标记技术的特点
• 2.3.3 ISSR技术实验操作
• 2.4 ISSR标记技术的应用
• 2.4.1 遗传作图构建
• 2.4.2 目的基因定位
• 2.4.3 种质资源研究
• 2.4.4 植物遗传多样性的分析
• 2.5 金银花的分子生物学研究进展
• 2.5.1 DNA提取
• 2.5.2 染色体核型分析
• 2.5.3 分子标记方法
• 2.5.4 同工酶分析方法
• 2.5.5 测序方法
• 2.5.6 其它研究
• 2.5.7 金银花的分子生物学研究现状
• 2.6 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 主要仪器
• 3.3 主要试剂
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 基因组DNA提取
• 3.4.2 ISSR反应体系的建立
• 3.4.3 引物筛选
• 3.4.4 ISSR扩增
• 3.4.5 数据统计及分析
• 4 结果与分析
• 4.1 金银花基因组DNA提取
• 4.1.1 不同提取方法对DNA浓度和纯度的影响
• 4.1.2 样品提取及检测
• 4.2 金银花ISSR反应体系优化
• 4.2.1 退火温度对ISSR—PCR反应的影响
• 4.2.2 Taq DNA聚合酶含量对ISSR—PCR反应的影响
• 4.2.3 dNTPs浓度对ISSR—PCR反应的影响
• 4.2.4 引物浓度对ISSR—PCR反应的影响
• 2+浓度对ISSR—PCR反应的影响'>4.2.5 Mg²⁺浓度对ISSR—PCR反应的影响
• 4.2.6 模板DNA浓度对ISSR—PCR反应的影响
• 4.3 金银花ISSR引物筛选
• 4.4 金银花ISSR扩增
• 4.5 数据统计及分析
• 4.5.1 金银花遗传多样性
• 4.5.2 金银花聚类分析
• 4.5.3 金银花主坐标分析
• 5 讨论
• 5.1 金银花DNA提取方法的确立
• 5.2 金银花ISSR—PCR反应体系的建立
• 5.3 金银花引物筛选
• 5.4 金银花遗传多样性
• 5.5 金银花主坐标分析和聚类分析
• 6 结论、展望及创新点
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 6.3 创新点
• 参考文献
• 附录A:本文所用中英文缩写对照表
• 附录B:主要试剂配置及说明
• 附录C:攻读硕士学位期间的主要学术成果
• 致谢