草鱼补体C9和穿孔素基因的克隆与表达研究

论文摘要

C9是补体溶解途径膜攻击复合体的一个成员。穿孔素是主要存在于自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞细胞毒颗粒中的一种糖蛋白,两个分子都可以聚合形成环状结构插入靶细胞膜导致细胞溶解,具有结构和功能的相似性。本研究对草鱼Ctenopharyngodon idellus补体C9（grass carp C,gcC9）和穿孔素（grass carpperforin,gcPFP）基因进行了克隆鉴定和特征分析。使用RACE方法扩增得到gcC9的cDNA全长2123 bp,开放阅读框包含1953bp,编码650个氨基酸,理论分子量71.045 kDa。结构域搜索和多序列比对显示gcC9含有血小板反应素（thrombospondin domain,TSP）、低密度脂蛋白受体（lowdensity lipoprotein receptor class A,LDL-R）、表皮生长因子前体（epidermal growthfactor precursor,EGFP）和与穿孔素相关的MACPF结构域。使用PCR和染色体步移法获得gcC9基因全长7003 bp,包含11个外显子和10个内含子,启动子区域822 bp,含有一个典型的TATA框及C/EBP,HSF,NF-AT,CHOP-C,HNF-3B,GATA-2,IK-2,EVI-1,AP-1,CP2和Oct-1等潜在的转录因子结合位点。RT-PCR和实时荧光定量PCR显示gcC9在草鱼未受精卵中已表达,受精后48 h gcC9表达量达到峰值。使用pQE-30载体对gcC9进行原核表达,获得重组蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,Western免疫印迹和RT-PCR显示gcC9在健康草鱼肝脏、肠道、脾脏、头肾、中肾、胸腺、皮肤、肌肉、鳃、心脏、脑和血液中表达,其中肝脏中表达量最高。实时荧光定量PCR分析显示经灭活的柱状黄杆菌Flavobacterium columnare诱导后1 d和7 d gcC9转录分别在肝脏和脾脏中有显著上调;Poly I:C诱导后1 d和3 d,在脾脏、肝脏和头肾中显著上调。使用简并引物扩增得到gcPFP-1和gcPFP-2的两个片段,使用RACE扩增获得gcPFP-1 cDNA全长2514 bp,开放阅读框包含1767 bp,编码588个氨基酸;gcPFP-2 cDNA全长2254 bp,其中开放阅读框1740 bp,编码579个氨基酸。gcPFP-1和gcPFP-2氨基酸相同率为58%,结构预测显示都存在MACPF和C2的PFP的特征结构域。gcPFP-1和gcPFP-2基因全长分别是4090 bp和3059 bp,均由4个外显子和3个内含子组成。RT-PCR显示gcPFP-1和gcPFP-2转录本在健康草鱼被检组织中都有分布,在草鱼早期发育阶段两个基因都在孵化后6 h开始表达,48 h表达量达到峰值,之后表达下降,呈现相同的表达规律。蛋白免疫印迹显示gcPFP-1和gcPFP-2可以交叉识别兔抗gcPFP抗体,草鱼组织中gcPFP-1和gcPFP-2均为68 kDa左右的蛋白,在健康草鱼组织中呈组成型表达。灭活的柱状黄杆菌诱导后7 d,在脾脏和头肾中gcPFP-1和gcPFP-2表达上调;Poly I:C诱导后1 d在脾脏,诱导后3 d在头肾和肠道中检测到gcPFP-1和gcPFP-2表达上调。两种诱导剂作用后3 d,肝脏中gcPFP-1表达上调而gcPFP-2表达下调。GcC9和gcPFP结构相关,氨基酸序列同源性为22%,共同含有MACPF和富含半胱氨酸的EGFP结构域,这些区域具有使蛋白构成跨膜通道和单体多聚化的功能。本研究首次提出鱼类穿孔素存在多种亚型,斑马鱼Danio rerio、黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis和三棘刺鱼Gasterosteus aculeatus等鱼类模式生物基因组数据库信息支持该论点,推测穿孔素多态性是硬骨鱼类进化过程中基因组复制的结果。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 第一章 文献综述:鱼类的补体和穿孔素
• 1 鱼类补体系统研究进展
• 1.1 鱼类补体活化途径与补体系统的进化
• 1.1.1 补体的活化途径
• 1.1.2 补体系统的进化
• 1.2 补体的合成和发生
• 1.2.1 补体成分的合成
• 1.2.2 鱼类补体的发生
• 1.3 鱼类补体末端成分（TCC）研究进展
• 1.3.1 MAC的组装
• 1.3.2 TCC的结构特征
• 1.3.3 鱼类TCC研究进展
• 1.3.4 TCC基因的进化
• 1.4 鱼类补体的特性
• 1.4.1 鱼类补体具有较低的反应温度
• 1.4.2 鱼类具有较高的ACP活性
• 1.4.3 鱼类补体成分的多态性
• 1.5 鱼类补体的生物学作用
• 1.5.1 鱼类补体和宿主防御
• 1.5.2 鱼类补体的溶血活性
• 1.5.3 鱼类补体的调理作用
• 1.5.4 鱼类补体引起的炎症反应
• 1.5.5 鱼类补体引起的免疫复合物的清除
• 2 穿孔素（PFP）研究进展
• 2.1 细胞毒T淋巴细胞（CTL）和PFP
• 2.2 PFP的结构与功能
• 2.2.1 PFP的分子结构
• 2.2.2 PFP和C9的结构关系
• 2.2.3 PFP功能区预测
• 2.3 PFP的作用机制
• 2.3.1 PFP的细胞内转运
• 2.3.2 PFP的溶细胞机制
• 2.3.3 PFP对杀伤细胞的保护机制
• 2.4 PFP的表达与调节
• 2.5 PFP的生物学作用
• 2.5.1 PFP与免疫调节
• 2.5.2 PFP与病原感染
• 2.5.3 PFP与肿瘤免疫
• 2.5.4 PFP与免疫疾病
• 2.5.5 PFP与移植反应
• 2.6 鱼类细胞毒与PFP研究进展
• 3 本研究的目的及内容
• 第二章 草鱼补体C9基因的克隆与表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 试剂盒与主要试剂
• 2.2.1 试剂盒与酶
• 2.2.2 主要生化试剂
• 2.3 载体和菌株
• 2.4 实验材料
• 2.5 核酸的提取和纯化
• 2.5.1 RNA的提取
• 2.5.2 基因组DNA的提取
• 2.6 GcC9 cDNA全长的获得与序列分析
• 2.6.1 SMART cDNA第一链的合成
• 2.6.2 RACE-PCR扩增gcC9 cDNA全长
• 2.6.3 GcC9 cDNA全长序列分析及系统进化树的构建
• 2.7 GcC9基因全长的获得及启动子区域的扩增
• 2.7.1 GcC9基因全长的的扩增
• 2.7.2 启动子区域的扩增
• 2.8 RT-PCR检测草鱼组织中C9转录水平的表达
• 2.9 草鱼早期发育阶段C9转录水平的表达
• 2.10 实时荧光定量PCR检测gcC9的诱导表达变化
• 2.10.1 实验鱼的诱导处理与样品的获得
• 2.10.2 质粒标准样品的制备
• 2.10.3 实时荧光定量PCR检测gcC9的诱导变化
• 2.11 GcC9的原核表达
• 2.11.1 原核表达载体的构建
• 2.11.2 重组蛋白的诱导表达
• 2.11.3 变性条件下纯化目的蛋白
• 2.12 兔多克隆抗体的制备
• 2.13 Western blot检测gcC9蛋白水平的表达
• 2.13.1 组织蛋白的提取
• 2.13.2 免疫印迹分析
• 3 结果
• 3.1 核酸质量和酶切效果
• 3.2 GcC9 cDNA全长及推导的氨基酸序列特征
• 3.3 GcC9的系统进化分析
• 3.4 GcC9的基因组结构和启动子分析
• 3.5 GcC9在健康草鱼组织转录水平的表达
• 3.6 早期发育阶段gcC9的表达
• 3.7 实时荧光定量PCR检测gcC9的诱导表达变化
• 3.8 GcC9的原核表达
• 3.9 Western blot检测gcC9组织蛋白水平的表达
• 4 讨论
• 第三章 草鱼穿孔素基因的克隆与表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 草鱼PFP基因cDNA全长获得与序列分析
• 2.2 GcPFP基因全长的扩增
• 2.3 RT-PCR检测草鱼成鱼组织中PFP转录水平的表达
• 2.4 草鱼早期发育阶段PFP转录水平的表达
• 2.5 实时荧光定量PCR检测gcPFP的诱导表达变化
• 2.6 GcPFP基因的原核表达
• 2.6.1 原核表达载体的构建
• 2.6.2 重组蛋白的诱导表达和纯化
• 2.6.3 多克隆抗体的制备
• 2.7 Western blot检测草鱼组织PFP蛋白水平的表达
• 3 结果
• 3.1 GcPFP cDNA全长及推断的氨基酸序列特征
• 3.1.1 GcPFP-1的cDNA及推断的氨基酸的性质
• 3.1.2 GcPFP-2的cDNA及推断的氨基酸的性质
• 3.2 GcPFP蛋白的结构分析
• 3.3 GcPFP的进化分析
• 3.4 GcPFP的基因组结构
• 3.5 PFP同源结构蛋白在模式生物基因组的多样性
• 3.6 GcPFP转录水平的表达
• 3.7 早期发育阶段gcPFP基因的表达
• 3.8 实时荧光定量PCR检测gcPFP的诱导表达变化
• 3.9 GcPFP的原核表达
• 3.10 Western blot检测gcPFP组织蛋白水平的表达
• 3.11 补体C9和PFP基因的进化关系
• 4 讨论
• 4.1 鱼类PFP基因存在多态性
• 4.2 PFP与补体C9的关系
• 参考文献
• 附录
• 致谢