灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及其表达特性的研究

论文摘要

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种传统药用真菌,在我国的传统医药学中应用历史悠久。被用于治疗多种疾病,如肝炎、高血压、高血脂、胃癌等。现代药理研究证明灵芝具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、抗衰老等药理作用。在中药现代化研究进程中,人们在灵芝中分离出其中一类重要的药理活性物质并证实为三萜类化合物。作为次级代谢产物,三萜类化合物在真菌中是经由甲羟戊酸途径后,形成两个五碳单位异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸。异戊二烯焦磷酸异构酶处于甲羟戊酸途径中的末端,催化无活性的异戊烯焦磷酸转化为有活性的亲核型异构体二甲基烯丙基焦磷酸,进而激活五碳化合物链的延伸反应,是萜类化合物合成过程中的一个重要的酶；而且它可能通过调节底物异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的比例来调节相关代谢终产物的流向。因此研究异戊二烯焦磷酸异构酶的表达特性,对于运用分子生物学的方法提高灵芝的药用价值方面有着重要的意义。本文通过已报道过的其他物种的IDI1氨基酸序列,设计简并引物,PCR扩增得到该基因599 bp的特异片段；然后基于获得的特异片段序列,设计特异性5’-SEFA引物,以灵芝菌丝体DNA为模板扩增该基因的5’端和启动子区；通过3’-RACE的方法,以反转录cDNA为模板,扩增得到该基因的3端和3’UTR。对得到的序列进行拼接、比对分析后,设计引物,分别以灵芝的基因组DNA和cDNA为模板扩增得到异戊二烯焦磷酸异构酶基因（idil）的基因组序列和cDNA全长序列。基因组全长为985 bp, cDNA全长为759 bp,其编码一个252个氨基酸组成的蛋白质。对灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的基因组序列和cDNA序列的对比分析表明,该基因由3个外显子和2个内含子构成,它们的长度分别为59 bp （intronl）、167 bp （intron2）。将该基因转入具有合成β-胡萝卜素生物合成途径的大肠杆菌TOP10 F’,发现该基因的导入使原菌株中的β-胡萝卜素生物积累显著增加,通过这种方法进一步证明了我们得到的基因是有功能的。通过软件分析,预测灵芝IDI1蛋白质分子量为28.70777kD,等电点为5.36。利用Plant care网站对得到灵芝idil基因及1202bp启动子序列预测分析,结果显示：灵芝idil基因的启动子区域含有17个CAAT box、1个推定的TATA box等典型的真核生物启动子元件。另外,还含2个Spl元件、1个ATC-motif、1个Box 4（光调控顺时作用元件）、1个LTR元件（低温响应元件）、1个Box-W1（真菌激发子响应元件）、2个auxin-responsiveelement（茁长素响应元件）、1个MYBHvl结合位点、4个CGTCA-motif、2个TGACG-motif（茉莉酸甲酯响应元件）、2个MBS（与干旱诱导有关的MYB结合位点）等。为了研究idil基因在不同发育时期基因的表达水平,本实验采用半定量RT-PCR的方法考查了该基因的不同发育阶段mRNA水平,结果显示idil基因在原基时期表达量最高；并用相同的方法对254μM茉莉酸甲酯诱导条件下idil基因在（?）mRNA水平表达情况进行了检测,结果显示idil基因表达受到激发并在24小时后表达量达到最大值。此外,本文在大肠杆菌体系中,实现了灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的原核表达；并对异源获得的蛋白进行了纯化,这为后续的实验奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 名词缩写
• 第一章 文献综述
• 一. 灵芝及其药用价值
• 二. 灵芝三萜的发现和研究进展
• 三. 三萜类化合物合成的途径的研究进展
• 四. 异戊二烯焦磷酸异构酶的发现及研究进展
• 1 异戊二烯焦磷酸异构酶的克隆及分类
• 2 异戊二烯焦磷酸异构酶的催化反应
• 3 异戊二烯焦磷酸异构酶的结构分析及催化机制
• 4 关于异戊二烯焦磷酸异构酶抑制剂的研究
• 五. 本课题的研究意义
• 第二章 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及功能验证
• 第一节 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 2 实验方法
• 2.1 灵芝基因组DNA的提取（CTAB法）
• 2.2 序列比较和异戊二烯焦磷酸异构酶基因特异片段简并引物的设计
• 2.3 异戊二烯焦磷酸异构酶基因特异片段的PCR扩增
• 2.4 扩增片段的回收、克隆
• 2.5 异戊二烯焦磷酸异构酶基因组DNA5'端的获得
• 2.6 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因cDNA3'端和3'UTR的获得
• 2.7 异戊二烯焦磷酸异构酶基因组序列全长的获得
• 2.8 异戊二烯焦磷酸异构酶cDNA全长的获得
• 3 结果与讨论
• 3.1 idi1基因特异片段的克隆及测序结果
• 3.2 灵芝idi1基因组DNA5'端及启动子区的获得
• 3.3 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因cDNA3'端序列的获得
• 3.4 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因组全长的获得
• 3.5 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶cDNA全长的获得
• 第二节 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶相关的生物信息学分析
• 1 分析所用到的一些软件来源
• 2 结果与讨论
• 2.1 灵芝IDI1蛋白质分子量及等电点预测
• 2.2 灵芝IDI1结构域预测
• 2.3 灵芝IDI1蛋白3D结构预测
• 2.4 灵芝idi11基因的系统发生树分析
• 2.5 灵芝idi1基因的启动子分析
• 第三节 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶的功能验证
• 1 原理
• 2 实验材料
• 2.1 菌株
• 2.2 试剂
• 2.3 质粒
• 3 实验方法
• 3.1 原核表达载体pTrcGlIPI质粒的构建
• 3.2 pTrc空载体的构建
• 3.3 产β-胡萝卜素工程菌的构建
• 3.4 颜色互补平板的获得
• 4 结果与讨论
• 4.1 pTrcGlIPI重组质粒酶切验证
• 4.2 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶大肠杆菌颜色互补
• 第三章 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶表达特性的研究
• 1 实验材料
• 1.1 菌株
• 1.2 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 灵芝菌丝体的培养
• 2.2 RNA的提取和cDNA的获得
• 2.3 引物设计
• 2.4 内参基因gpd的扩增
• 2.5 检测基因idi1在mRNA水平的表达差异
• 3 结果与讨论
• 3.1 灵芝idi1基因在菌丝不同发育阶段RNA水平
• 3.2 灵芝idi1基因对MeJA的响应
• 第四章 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶原核表达和蛋白纯化
• 1 实验材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂
• 2 试验方法
• 2.1 表达载体的构建
• 2.2 IDI1蛋白的诱导表达
• 2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 2.4 异戊二烯焦磷酸异构酶蛋白纯化
• 3 结果与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢