海洋细菌（Agarivorans albus YKW-34）产生的褐藻胶裂解酶及琼胶酶的研究

论文摘要

从韩国东海岸的蝾螺（Turbinidae batillus cornutus）肠道中筛选出的菌株YKW-34,能够有效降解一些褐藻和红藻的细胞壁多糖。通过分析其16S rRNA基因序列,将该菌株鉴定为Agarivorans albus,命名为Agarivorans albus YKW-34 （中文名暂定为白色琼胶贪食菌YKW-34）。A. albus YKW-34在其生长培养基marine broth中不产生多糖降解酶;但在以多糖作为碳源的培养基中可产生1种褐藻胶裂解酶和2种琼胶酶。本研究旨在对A. albus YKW-34产生的褐藻胶裂解酶和琼胶酶进行生产优化、分离纯化、性质研究及基因克隆,以便为两种酶的工业化应用提供理论依据和实践基础。通过单因子和正交实验,对A. albus YKW-34产褐藻胶裂解酶的培养条件进行了优化。结果表明,其最适碳源为海带粉0.5% （w/v）,氮源为KNO3 0.1% （w/v）,最佳种龄为12h,接种量为10%,最适培养基初始pH值为8.0,培养温度为25°C。在上述条件下,110rpm震荡培养48h,褐藻胶裂解酶产量达到最大值5U/ml。在发酵培养基中添加过量的多糖或单糖可抑制产酶;增加氮源的浓度或种类有利于菌株的生长,但也会抑制产酶。通过聚醚酰亚胺沉淀,阴离子交换、疏水及凝胶过滤色谱,进行了A. albus YKW-34产褐藻胶裂解酶的纯化。其回收率为7%,纯化倍数为25倍。SDS-PAGE和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽链组成,分子量为60kDa。等电聚焦实验表明其等电点为5.5-5.7。此酶的最适pH为7.0,在pH 7.0?10.0稳定;最适温度为30?40°C,低于50°C时稳定。此酶具有钠/钾离子依赖性。透析除去反应体系中钠/钾离子后,酶活力丧失;添加钠/钾离子后,酶活力可完全恢复。此酶对还原剂如β-巯基乙醇和DTT、金属离子络合剂如EDTA和EGTA具有耐受性;变性剂如SDS和尿素可使酶活力提高30%。底物专一性实验表明,此酶能同时降解甘露糖醛酸和古罗糖醛酸片断。通过单因子实验、Plackett-Burman设计及响应面设计实验,对A. albus YKW-34发酵产琼胶酶的条件进行了优化。单因子实验表明,最佳碳源和氮源分别为琼胶和酵母浸膏,最适培养温度为25°C。在此条件下,确定最适培养时间为12h。Plackett-Burman设计表明琼胶、酵母浸膏及初始pH三个因素对琼胶酶产量具有显著影响（P<0.05）。响应面设计实验确定此三个因素的最适水平为:琼胶0.23%,酵母浸膏0.27%,初始pH为7.81。经优化后,琼胶酶产量由0.23U/ml提高至0.87U/ml。用活性染色法对琼胶酶进行了原位测定,结果表明,琼胶酶为培养液中的主要蛋白质组分,其分子量约为50kDa。离子交换色谱表明,A. albus YKW-34能产生两种琼胶酶,将其分别命名为AgaA34和AgaB34,其中AgaA34产量为747U/l,AgaB34产量为83U/l。AgaA34进一步通过凝胶过滤色谱得以纯化。SDS-PAGE和凝胶过滤色谱表明此酶由单一肽链组成,分子量为50kDa。纯化的回收率为7%,纯化倍数为25倍。经测定,AgaA34的N端氨基酸序列为ASLVTSFEEA,与糖基水解酶家族50的琼胶酶相似;AgaB34的N端氨基酸序列为ADWDNIPIPAELDAG,与糖基水解酶家族16的琼胶酶相似。AgaA34的酶学性质分析表明,此酶的最适pH为8.0,在pH 6.0-11.0稳定;最适温度为40°C,在温度≤50°C时稳定。MALDI-TOF MS和13C NMR分析表明AgaA34的琼胶酶解产物为75mol%新琼二糖和25mol%新琼四糖。薄层色谱表明此酶能将新琼四糖降解为新琼二糖。以琼脂糖和新琼四糖为底物,此酶的催化效率分别为4.04×103和8.1×102s–1M–1。海水中的常见金属离子对AgaA34的酶活力无显著影响。此酶对SDS和尿素具有耐受作用;β-巯基乙醇和DTT可提高酶活力。本研究建立了A. albus YKW-34的基因组文库,并从此文库中克隆出琼胶酶基因（agaB34）。此基因长1362bp,编码453个氨基酸。根据同源性分析,判断其氨基酸序列1-23aa为信号肽,25-297aa为糖基水解酶家族16催化组件,316-452aa为碳水化合物结合组件。成熟蛋白的分子量预测为48,637Da,等电点预测为6.34。通过构建N端包含信号肽序列及C端镶嵌6个组氨酸的琼胶酶重组质粒,以大肠杆菌DH5α为宿主对该酶进行了重组表达。结果表明,重组琼胶酶（rAgaB34）可分泌至胞外,最高产量为1670U/l。rAgaB34可经亲和色谱进行一步纯化,回收率为80%,纯化倍数为15倍。rAgaB34分子量为49kDa,其终产物为新琼四糖。其结构域及终产物表明其属于糖基水解酶家族16成员。此酶的最适pH为7.0,在pH 5.0-9.0稳定;最适温度为30°C,在温度≤50°C时稳定。以琼脂糖为底物,此酶的比活力和催化效率分别为242U/mg和1.7×106s–1M–1。此酶对EDTA和EGTA、SDS和尿素及β-巯基乙醇和DTT具有耐受性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 立题目的及意义
• 0.2 Agarivorans 属的微生物
• 0.2.1 Agarivorans 属微生物的基本性质
• 0.2.2 Agarivorans 属微生物的产酶类型
• 0.3 褐藻胶及褐藻胶裂解酶
• 0.3.1 褐藻细胞壁的多糖组成
• 0.3.2 褐藻胶的结构及性质
• 0.3.3 褐藻胶裂解酶的研究进展
• 0.3.4 褐藻胶裂解酶的应用
• 0.4 琼胶及琼胶酶
• 0.4.1 红藻细胞壁的多糖组成
• 0.4.2 琼胶的结构及性质
• 0.4.3 琼胶酶的研究进展
• 0.4.4 琼胶酶的应用
• 1 菌株 YKW-34 的菌种鉴定及其所产多糖降解酶类型的分析
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 试剂
• 1.1.2 仪器
• 1.1.3 菌种
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种鉴定
• 1.2.1.1 菌株基因组 DNA 的制备
• 1.2.1.2 16S rRNA 基因的 PCR 扩增及 PCR 产物的克隆
• 1.2.1.3 DNA 测序及菌种鉴定
• 1.2.2 菌株产酶类型的鉴定
• 1.2.2.1 培养基组成
• 1.2.2.2 培养条件
• 1.2.2.3 生物量的测定
• 1.2.2.4 酶活力的测定
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 菌株 YKW-34 的生长曲线
• 1.3.2 菌种鉴定
• 1.3.3 菌株的产酶类型
• 1.4 小结
• 2 Agarivorans albus YKW-34 产褐藻胶裂解酶的培养基组成及培养条件的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂与仪器
• 2.1.2 培养基组成及培养条件
• 2.1.3 生物量及酶活力的测定
• 2.1.4 数据的统计学分析方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 碳源的优化
• 2.2.2 氮源的优化
• 2.2.3 碳氮比及接种量的优化
• 2.2.4 种龄的优化
• 2.2.5 初始pH 值的优化
• 2.2.6 培养温度的优化
• 2.2.7 最适培养条件下的生长曲线及产酶曲线
• 2.3 小结
• 3 Agarivorans albus YKW-34 产褐藻胶裂解酶的分离纯化及酶学性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂与仪器
• 3.1.2 菌株培养
• 3.1.3 褐藻胶裂解酶活力的测定
• 3.1.4 蛋白质含量的测定
• 3.1.5 褐藻胶裂解酶的分离纯化
• 3.1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.1.7 褐藻胶裂解酶等电点的测定
• 3.1.8 褐藻胶裂解酶温度和pH 活性及稳定性的测定
• 3.1.9 金属离子及各种有机试剂对褐藻胶裂解酶活力影响的测定
• 3.1.10 褐藻胶裂解酶的底物专一性分析
• 3.1.11 褐藻胶裂解酶的动力学性质的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 酶的纯化
• 3.2.2 酶比活力
• 3.2.3 酶的分子量及等电点
• 3.2.4 酶的温度及pH 性质
• 3.2.5 金属离子及各种有机试剂对酶活力影响
• 3.2.6 酶的底物专一性
• 3.2.7 酶的动力学性质
• 3.3 小结
• 4 Agarivorans albus YKW-34 产琼胶酶的培养基组成及培养条件的优化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂与仪器
• 4.1.2 菌株培养
• 4.1.3 生物量及酶活力的测定
• 4.1.4 单因素分析
• 4.1.5 统计学设计
• 4.1.5.1 Plackett-Burman 设计
• 4.1.5.2 响应面设计
• 4.1.6 琼胶酶的原位检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 最适碳源、氮源、培养温度的确定
• 4.2.2 重要影响因素的筛选
• 4.2.3 重要影响因素的优化
• 4.2.4 优化前后菌株的生长曲线及产酶曲线的比较
• 4.2.5 琼胶酶的原位检测
• 4.3 小结
• 5 Agarivorans albus YKW-34 产琼胶酶 AgaA34 及 AgaB34 的分离纯化及 AgaA34 的酶学性质研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 菌株培养
• 5.1.3 琼胶酶活力及蛋白质含量的测定
• 5.1.4 琼胶酶的分离纯化
• 5.1.5 蛋白质电泳
• 5.1.6 琼胶酶氮端氨基酸序列的测定
• 5.1.7 琼胶酶温度和pH 活性及稳定性的测定
• 5.1.8 琼胶酶的底物专一性及裂解方式的分析
• 5.1.9 各种试剂对琼胶酶活力影响的测定
• 5.1.10 琼胶酶的动力学性质的测定
• 5.1.11 酶解产物的分析
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 AgaA34 及 AgaB34 的纯化
• 5.2.2 AgaA34 及 AgaB34 的氮端序列
• 5.2.3 AgaA34 的温度及pH 性质
• 5.2.4 AgaA34 的底物专一性及裂解方式
• 5.2.5 各种试剂对 AgaA34 活力影响
• 5.2.6 AgaA34 的动力学性质
• 5.2.7 AgaA34 酶解产物
• 5.3 小结
• 6 Agarivorans albus YKW-34 产琼胶酶 AgaB34 的基因克隆、重组表达及重组酶的性质研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试剂与仪器
• 6.1.2 菌株及培养条件
• 6.1.3 琼胶酶的基因克隆
• 6.1.3.1 A. albus 基因组 DNA 的制备、酶切及片段的纯化
• 6.1.3.2 pUC18 质粒 DNA 的制备、酶切及去磷酸化
• 6.1.3.3 基因组 DNA 片段与载体的连接
• 6.1.3.4 E. coli 感受态细胞的制备及重组质粒的转化
• 6.1.3.5 阳性克隆的筛选及基因测序
• 6.1.3.6 基因序列生物学数据的分析
• 6.1.4 重组琼胶酶的胞外表达
• 6.1.4.1 含6×His-tagged 琼胶酶基因载体的构建
• 6.1.4.2 6×His-tagged 琼胶酶的表达
• 6.1.5 重组琼胶酶的纯化
• 6.1.6 琼胶酶活力的测定
• 6.1.7 重组琼胶酶基本酶学性质测定
• 6.1.8 重组琼胶酶的酶解产物分析
• 6.1.9 琼胶酶基因序列号
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 琼胶酶基因的克隆
• 6.2.2 琼胶酶氨基酸序列的分析
• 6.2.3 重组琼胶酶的表达和纯化
• 6.2.4 重组琼胶酶的基本酶学性质
• 6.2.5 重组琼胶酶的酶解产物
• 6.2.6 原始琼胶酶与重组琼胶酶的比较
• 6.3 小结
• 论文总结及创新点
• 后期工作展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简历
• 在学期间发表的论文
• 致谢