论文摘要
细胞发生恶性变化具有复杂的分子机制,常涉及到多基因、多途径的病理改变过程,细胞总蛋白质表达谱的改变最能真实地反应细胞的这些病理变化。本研究着眼于胃腺癌组织总蛋白质表达谱的改变,应用蛋白质组学技术寻找与鉴定正常胃组织与胃腺癌组织之间差异表达的蛋白质,从而选择其中一种对其致癌作用文献报道很少以及功能未明确的差异表达的蛋白质,应用western blot和免疫组化方法,探索它作为胃腺癌生物标志物的可能性,并利用基因克隆技术构建它的真核表达载体、利用基因转染技术初步探讨它的致胃癌作用。本研究第一部分从临床获得10例胃腺癌患者的胃腺癌组织及与其配对的相同患者的正常胃粘膜组织,首先应用双相电泳技术对正常胃组织及胃腺癌组织的总蛋白质表达谱进行了对比分析,发现了42个表达差异至少两倍的蛋白质点;接着应用质谱技术对差异蛋白质点进行分析,成功地鉴定出42种不同的蛋白质。其中,胃腺癌组织表达下调的有垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP protein,PACAP）等29种;胃腺癌组织表达上调的有波形蛋白（vimentin）等13种。本研究第二部分应用western blot和免疫组化方法进一步验证已经质谱鉴定的差异表达的蛋白质:胃腺癌组织表达降低的人类蛋白酶体激活剂PA28β亚单位（proteasome activator hPA28 suunit beta,PA28β）。应用这两种方法分别检测40例冻存和石蜡包埋的胃腺癌组织及与其配对的正常胃组织PA28β的表达。发现PA28β在28例胃腺癌组织中低表达,低表达率为70.0%（28/40,western blot法）;免疫组化结果也显示,PA28β在38例正常胃黏膜固有层胃腺细胞中表达,但在29例胃腺癌细胞中,PA28β表达降低或缺乏表达（29/41,72.5%）。初步结果表明PA28β可作为胃腺癌的生物标志物。本研究的第三部分对PA28β的致胃癌作用进行初步探讨。首先通过RT-PCR,获得PA28β全长cDNA序列,构建PA28β基因的真核表达载体,并转染入胃腺癌MKN-45细胞中。通过MTT测定方法、Brdu掺入实验和克隆形成实验,研究转染PA28β基因前后细胞增殖的变化;应用软琼脂集落形成实验研究转染PA28β基因前后MKN-45细胞的致瘤性（恶性度）的变化。结果显示MKN-45细胞转染PA28β基因后,细胞增殖减弱,致瘤性减弱,统计学结果表明与未转染对照及空载体对照比较,差异非常显著（P<0.01）。初步结果提示:PA28β可导致细胞增殖和恶性程度的变化,其表达下降与胃腺癌的发生发展有关,相关机制有待进一步研究。
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