基于cDNA-AFLP分析茶树喷施化学杀虫剂前后的基因表达谱差异

论文摘要

化学防治是茶园管理中不可或缺的手段之一,但是在人们受益的同时,其对茶树体内的生理生化反应和自身对病、虫害防御体系是否产生负面影响值得关注。论文基于cDNA-AFLP技术,研究茶树被喷施目前茶园常用化学杀虫剂吡虫啉前后的基因表达谱差异,并对差异表达基因进行生物信息学分析和qRT-PCR验证。主要结果如下：（1）利用内切酶分析软件,对GenBank中登录的有关茶树基因的cDNA全长序列和EST进行酶切分析,结果表明ApoI/Msel是利用cDNA-AFLP技术对茶树进行差异表达谱分析的最佳酶切组合。（2）以优化后的cDNA-AFLP技术分析茶树喷施吡虫啉（出厂推荐使用浓度）前后的基因表达谱差异,结果总共获得了220条差异表达片段（TDF）,经回收、克隆和测序得到160条,其中诱导表达的有94条,抑制下调的有66条。差异条带长度总体分布在113-822bp之间,其中大部分条带长度集中在200-300bp和300-400bp之间,分别占总数的39%与30%,而且还有一些片段长度大于500bp。（3）利用BLAST进行同源性比对分析发现,160条TDF中有8条的比对结果出现重复,余下的152条中有26条功能尚不清楚,18条为没有参比序列相匹配的新序列；对剩下的108个与已知功能基因相关的TDF序列进行功能预测,结果表明这些条带可以分别归属于信号传导、光合与能量代谢、转录调控、抗病与抗逆蛋白、跨膜运输、应激反应和物质代谢等7个功能类型。其中,对于诱导上调和抑制下调的TDF来说,其分属的功能类型共同特点是二者中与光合与能量代谢,以及物质代谢相关的基因所占比例最高,分别占各自总数的41%与36%；而二者间不同之处是,前者与转录调控功能相关的基因所占比例明显少于后者,分别占各自总数的9%和16%；二者与其它功能类型的基因所占各自总数的比例差别不大。（4）为了验证差异条带的正确性和吡虫啉对茶树基因表达影响特点,分别选择了2条诱导上调TDF （17N3、26P5）和4条抑制下调TDF （12G、18J2、25D1和1201）进行qRT-PCR分析。结果表明所选择的2条诱导上调TDF相关基因表达量在吡虫啉处理后2d上升到最大值,随之降低,至第8d与对照差异不大；4条抑制下调TDF相关基因表达量在处理后4d下降到最低值,随后逐渐回升,到处理后8d与对照相差不明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表清单
• 1 文献综述
• 1.1 农药对植物生理生化影响的研究进展
• 1.1.1 农药对植物根系活力的影响
• 1.1.2 农药对植物生长发育及生理过程的影响
• 1.1.3 农药对植物次生物质及次生代谢的影响
• 1.1.4 农药对植物主要营养物质的影响
• 1.1.5 农药对植物代谢酶活性的影响
• 1.1.6 农药对植物活性氧代谢的影响
• 1.2 化学农药在茶树上的应用研究
• 1.3 基因表达差异谱的研究方法
• 2 引言
• 2.1 研究意义及目的
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 处理与采样
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 用于cDNA-AFLP双酶切的限制性内切酶酶切频率的预测分析
• 3.3.2 总RNA的提取和检测
• 3.3.3 cDNA第一链的合成
• 3.3.4 cDNA第二链合成及末端平滑化
• 3.3.5 cDNA的精制
• 3.3.6 cDNA双酶切
• 3.3.7 接头连接
• 3.3.8 预扩增
• 3.3.9 选择性扩增
• 3.3.10 聚丙烯酞胺凝胶电泳及银染
• 3.3.11 差异条带的回收、克隆、测序
• 3.3.12 差异基因的定量分析
• 3.3.13 温度对银染结果的影响
• 3.3.14 ApoI/MseI与EcoRI/MseI酶切效果的对比
• 4 结果与分析
• 4.1 茶树叶片总RNA的提取与质量检测
• 4.2 用于茶树cDNA-AFLP分析的条件优化
• 4.2.1 两个限制性内切酶组合的理论优选
• 4.2.2 ApoI/MseI双酶切的效果检测
• 4.2.3 ApoI/MseI与EcoRI/MseI预扩增效果比较
• 4.2.4 ApoI/MseI与EcoRI/MseI选择性扩增效果的比较
• 4.2.5 ApoI/MseI与EcoRI/MseI的差异条带比较
• 4.3 喷施吡虫啉前后茶树叶片的基因表达谱差异比较
• 4.3.1 cDNA-AFLP差异图谱分析
• 4.3.2 差异条带的统计分析
• 4.3.3 差异条带的回收、克隆、测序与验证
• 4.4 差异条带序列的生物信息学分析
• 4.4.1 差异片段序列的同源性分析
• 4.4.2 差异条带序列的基因功能分类
• 4.5 差异表达片段表达的qRT-PCR分析
• 5 讨论
• 5.1 酶切组合的选择
• 5.2 温度对银染结果的影响
• 5.3 差异基因的定量分析
• 5.4 cDNA-AFLP技术
• 5.4.1 cDNA-AFLP技术原理
• 5.4.2 cDNA-AFLP的技术特点
• 5.4.3 cDNA-AFLP技术在非生物和生物胁迫方面的实例应用
• 5.5 化学杀虫剂诱导的差异基因的功能分析和功能预测
• 5.5.1 上调基因的功能分析和功能预测
• 5.5.2 下调基因的功能分析和功能预测
• 6 结论
• 参考文献
• 附录A 中英文缩写与注释
• 致谢
• 作者简介
• 成果清单