论文摘要
近年来肺癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势,已成为对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。早期诊断和治疗是防治肺癌、降低其死亡率的有效办法,但由于肺癌临床症状隐匿,导致早期诊断难度较大,而解决这个难题的基础是寻找肺癌发生发展过程中有标志性意义的基因或蛋白,即肺癌标志。分子生物学研究表明,肺癌的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程,涉及到大量相关基因及其蛋白质的异常变化。基因的功能是通过其表达的蛋白质来实现的,因此肺癌可以被认为是一种蛋白质异常病。从蛋白质水平研究肺癌,寻找高特异度和灵敏度的肺癌分子标志,进而阐明其表达水平的变化与肺癌发生的关系,对其早期诊断、普查和治疗具有重要的理论和实际意义。蛋白质组学方法己被广泛应用于寻找肿瘤相关蛋白的研究,经典方法为比较蛋白质组学（Comparative Proteomics）,即比较肿瘤组织/细胞与对照组织/细胞表达的全部蛋白质,筛选不同条件下的差异蛋白质。但由于肿瘤组织中既有实质也有间质,间质的干扰导致实验结果可信度下降。血清学蛋白质组分析方法（serologic proteome analysis,SERPA）是从体液免疫的角度,采用双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）技术和免疫印迹技术相结合的一种新方法。由于肿瘤间质无显著特异性,基本不会刺激机体产生抗体,因此SERPA可在一定程度上避免间质干扰造成的假阳性。但由于血清学检查的局限性,利用血清中的抗体来筛选肿瘤相关蛋白,存在敏感性及特异性变化较大的缺点。比较蛋白质组学方法和血清学蛋白质组分析方法联合应用可提高蛋白质组学方法的准确性和可靠性,是寻找肿瘤相关蛋白较为理想的方法。既往蛋白质组学研究多以质谱鉴定的结果为结论,但由于从2-DE到质谱分析整个技术流程长,影响因素较多,虽然筛选、鉴定出一些肺癌差异蛋白质,但是对其表达情况和在疾病发生中的作用还有待进一步研究,而且差异比较的重复性也需要各个层次的验证。故为了保证初筛鉴定结果的可信度及进一步研究的科学性,对2-DE筛出的差异蛋白进行验证十分必要。寻找高特异度和高灵敏度的生物标志是肺癌早期诊断和治疗的重要方法,然而,目前的研究报道仍然存在着缺陷,现有的肿瘤分子标志大多是针对中、晚期肿瘤的诊断,因此不能真正降低肿瘤的发病率。而且肺癌的各种病理类型各有不同的发病机制,单一病理类型的研究可能会更为准确。为了筛选、鉴定出早期肺鳞癌相关的蛋白质,以Ⅰ期肺鳞癌组织以及相应的癌旁正常肺组织、I期肺鳞癌患者血清和健康正常人血清为研究对象和材料,联合应用比较蛋白质组学方法和血清学蛋白质组分析方法筛选早期肺鳞癌相关蛋白。本研究可丰富人类对肺组织蛋白质组的认识,同时通过相应的鉴定和验证,期望发现肺鳞癌中特异性的蛋白质,为肺癌的早期诊断提供依据,也将有助于进一步揭示肺癌发生发展的分子机制。研究目的1.通过优化双向电泳及免疫印迹技术,建立稳定的比较蛋白质组学和血清学蛋白质组技术平台,结合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（Matrix-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）技术,筛选和鉴定出早期肺鳞癌差异蛋白质。2.通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）、Western Blot、免疫组织化学方法检测肺鳞癌差异蛋白在基因、蛋白水平的表达情况,验证蛋白质组学方法筛选结果的可靠性和准确性,并结合临床病理信息进行分析,初步探讨其在肺鳞癌发生、发展中的表达变化。材料与方法1.研究对象组织标本:收集22例肺鳞癌患者的癌组织及相应的癌旁正常组织,其中Ⅰ期患者6例,Ⅱ期4例,Ⅲ期12例;高分化患者5例,中分化7例、低分化10例。所有肺组织标本均经过组织病理学确诊。血清标本:收集12例Ⅰ期肺鳞癌患者及12例正常体检人群的血清。2.研究方法2.1蛋白质组学方法筛选、鉴定早期肺鳞癌相关蛋白2.1.1蛋白样品的处理分别提取6例Ⅰ期肺鳞癌患者癌组织及癌旁正常肺组织的可溶性总蛋白,Bradford方法测定蛋白样品浓度,作为分析型和制备型凝胶蛋白上样量的依据,蛋白样品应用2-D clean-up kit进行除杂处理。2.1.2比较蛋白质组学分析分别将肺鳞癌组和癌旁正常组标本等质量混合,在优化的2-DE条件下,每组混合样本以分析型蛋白上样量（11cm pH3～10 IPG胶条）在相同条件下进行3次2-DE,硝酸银染色后得到肺鳞癌分析型双向电泳凝胶图谱,用Imagescanner图像扫描仪获取凝胶图像,采用ImageMaster 2D Platinum 6.0图像分析软件对2组的全蛋白质组表达谱进行差异分析,分别以各组中2-DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶,进行组间的匹配分析。2.1.3血清学蛋白质组分析方法（SESPA）（11cm pH3～10 IPG胶条）,2块凝胶转膜后分别与肺鳞癌组混合血清及对照组混合血清孵育,经二抗反应和DAB试剂盒显色后获取肺鳞癌组织与肺鳞癌患者血清及对照混合血清的Western Blot反应图谱。经图像分析软件及人工比对,找出NC膜上差异反应蛋白点并在平行凝胶上定位。结合比较蛋白质组学方法所获取的差异蛋白质点图谱,选择二者共有的差异蛋白质作为肺鳞癌差异蛋白。2.1.4肺鳞癌相关蛋白的鉴定将比较蛋白质组学和SERPA得到的共有差异蛋白点从制备型凝胶（17cmpH3～10,IPG胶条）上挖下,胶内酶解后,经MALDI-TOF-MS和串联质谱（tandemmass spectrometry,TMS）进行分析,获得肽质量指纹图谱（Peptide MassFingerprint,PMF）或肽序列标签（Peptide Sequence Tag,PST）,用Mascot软件搜索蛋白质数据库,联合生物信息学,鉴定差异蛋白质性质,作为肺鳞癌相关蛋白的候选标志。2.2肺鳞癌差异蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的表达验证2.2.1基因水平的验证提取肺鳞癌患者癌组织和癌旁正常组织的总RNA,逆转录合成cDNA,以β-actin为内参照,采用FQ-PCR方法扩增肺鳞癌相关蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的基因片段,分析转录表达情况及其与患者临床病理特征的关系。2.2.2蛋白表达水平的验证提取肺鳞癌患者癌组织及其癌旁正常组织的可溶性总蛋白,Bradford法测定样品的蛋白质浓度。取适量样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,将凝胶上分离的蛋白质转移至硝酸纤维素（NC）膜上,加入特异性一抗和二抗孵育后ECL显色,以β-actin为内参照,检测肺鳞癌相关蛋白的表达情况。2.2.3细胞学定位鳞癌组织及其癌旁正常组织经福尔马林固定、石蜡包埋,连续切片。采用过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase,SP）免疫组织化学染色,检测肺鳞癌相关蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的细胞学定位及其蛋白表达情况。3.统计学处理利用SPSS12.0软件对数据进行统计分析。采用t检验比较目的基因的表达差异,卡方检验比较目的蛋白阳性表达率的差异,以α=0.05为检验水准。结果1.早期肺鳞癌相关蛋白的筛选和鉴定1.1对肺鳞癌组和癌旁正常组织组蛋白混合样品分别进行3次2-DE,进行组内和组间匹配,建立分辨率及重复性较高的蛋白质表达谱。肺鳞癌组平均匹配蛋白点数为626个,平均匹配率为87.46%;癌旁正常组平均匹配蛋白点数为602个,平均匹配率为89.21%。在匹配分析的基础上筛选出早期肺鳞癌差异蛋白点38个。1.2建立分辨率及重复性较高的肺鳞癌组织蛋白混合样品与肺鳞癌血清和对照血清的Western Blot图谱,经软件分析及人工比对筛选出16个差异反应蛋白点,并在转膜后的银染凝胶和平行胶中找到相对应的蛋白质点。结合肺鳞癌组和癌旁对照组组织蛋白混合样品的差异蛋白质点图谱,筛选出10个二者共有的差异蛋白质点。1.3在制备胶上挖取相应的差异蛋白点,经MALDI-TOF-MS或TMS进行分析,获得PMF或PST,搜索NCBInr蛋白质数据库,10个差异蛋白质最终鉴定为膜联蛋白Ⅰ（annexinⅠ,ANXⅠ）、热休克蛋白27（heat shock protein 27,HSP27）、ras相关核蛋白（ras-related nuclear protein,Ran）、Sloo钙结合蛋白A9（S100 calcin-binding protein A9,S100A9）、铁蛋白轻链（ferritin lightpolypeptide,FLP）、硫氧还原蛋白过氧化物酶3（peroxiredoxin 3,PRX3）、烯酰辅酶A水合酶1（Enoyl Coenzyme A hydratase l,ECH1）、翻译延伸因子（elongation factor,EF-Tu）、多聚胞嘧啶结合蛋白Ⅰ（poly cR binding proteinⅠ,PCBP1）、PWP1相互作用蛋白4（PWP1-interacting protein 4）。2.肺鳞癌相关蛋白ANXⅠ、HSP27及Ran的表达验证2.1 ANXⅠ的表达验证结果荧光定量RT-PCR结果显示肺鳞癌组织中ANXⅠ基因mRNA的表达水平是癌旁正常组织中的1.81倍,差异具有统计学意义（P<0.05）。低分化肺鳞癌组织中ANXⅠmRNA的表达水平高于高、中分化癌组织,ANXⅠ在早期（Ⅰ期+Ⅱ期）肺鳞癌组织和非早期（Ⅲ期）癌组织中mRNA表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。Western Blot结果表明肺鳞癌组织中ANXⅠ的表达水平明显高于癌旁正常组织,ANXⅠ在低分化肺鳞癌组织中的蛋白表达水平高于高、中分化癌组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。ANXⅠ在早期（Ⅰ期+Ⅱ期）肺鳞癌组织和非早期（Ⅲ期）癌组织中蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。免疫组化结果显示ANXⅠ主要定位于胞膜和胞浆,肺鳞癌组织和癌旁正常组织中未发现阳性定位改变。ANXⅠ在肺鳞癌组织和癌旁正常组织中的总阳性表达率分别为72.73%（16/22）和31.82%（7/22）,强阳性表达率分别为40.91%和9.09%。与癌旁正常组织相比,ANXⅠ在肺鳞癌组织中的总阳性表达率和强阳性表达率显著增高（P<0.05）。Western Blot和免疫组化结果与蛋白质组学结果有相同的差异趋势。2.2 HSP27的表达验证结果荧光定量RT-PCR结果显示HSP27在肺鳞癌组织和癌旁正常组织中mRNA的表达水平差异无统计学意义。Western Blot结果显示HSP27在肺鳞癌组织中蛋白表达水平显著高于癌旁正常组织（P<0.05）,HSP27在低分化肺鳞癌组织中的蛋白表达水平显著高于高、中分化癌组织（P<0.05）。HSP27在早期（Ⅰ期+Ⅱ期）肺鳞癌组织和非早期（Ⅲ期）癌组织中的蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。HSP27阳性表达主要定位于细胞胞膜,未发现肺鳞癌和癌旁正常组织中的阳性定位的变化。HSP27在肺鳞癌组织中的总阳性表达率为72.27%（17/22）,强阳性表达率为31.82%（7/22）;在癌旁正常组织的总阳性表达率为18.18%（4/22）,未发现强阳性表达。与癌旁正常组织相比较,HSP27在肺鳞癌中的总阳性表达率和强阳性表达率显著增高（P<0.05）。HSP27的Western Blot和免疫组化结果与蛋白质组学结果有相同的差异趋势。2.3 Ran的表达验证结果Ran在肺鳞癌组织中mRNA表达水平是癌旁正常组织的.2.35倍（P<0.05）。Ran在非早期（Ⅲ期）肺鳞癌组织中mRNA的表达水平高于早期（Ⅰ期+Ⅱ期）癌组织（P<0.05）。Ran在低分化肺鳞癌组织和高、中分化癌组织中mRNA表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot分析结果显示Ran在肺鳞癌组织中的表达高于癌旁组织,Ran在非早期（Ⅲ期）肺鳞癌组织中的蛋白表达水平高于早期（Ⅰ期+Ⅱ期）癌组织（P<0.05）。Ran在低分化肺鳞癌组织和高、中分化癌组织中蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。Ran阳性表达定位于细胞胞核,在肺鳞癌组织和癌旁正常组织中的总阳性表达率分别为100%（22/22）、59.09%（13/22）,强阳性表达率分别为72.73%（16/22）、4.55%（1/22）。与癌旁正常组织相比较,Ran在肺鳞癌组织中的总阳性表达率和强阳性表达率显著增高（P<0.05）。结论1.联合应用比较蛋白质组学和血清学蛋白质组学方法,质谱鉴定出10种肺鳞癌相关蛋白。2.ANXⅠ、HSP27及Ran在肺鳞癌组织中的蛋白表达水平高于癌旁正常组织中的表达水平,蛋白表达水平的变化趋势与蛋白质组学方法的研究结果一致。其在肺鳞癌发生、发展过程中可能发挥重要作用,Ran可能成为肺鳞癌早期诊断的重要辅助指标。