论文摘要
为了获取广谱、高效的乳酸菌细菌素产生菌,本文对分离自四川传统发酵肉制品（香肠、腊肉）中的91株乳酸菌,以大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、藤黄微球菌（Micrococcusluteus）10209、铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC 27853、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为指示菌,采用打孔法初筛,进一步通过排除有机酸、过氧化氢干扰及发酵液的蛋白酶降解实验复筛,得到1株产广谱（能抑制G+菌和G-菌）细菌素的菌株C50-6,经表型特征和16S rDNA系统发育特征鉴定为戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）。采用单因素实验,对戊糖乳杆菌C50-6产细菌素的培养时间、温度、起始pH条件进行优化,结果表明:将菌株C50-6种子液按2%接种量接入起始pH6.0的MRS肉汤,经30℃培养36h能获得较高的细菌素产量,其发酵液效价可达1151IU/ml,是原培养条件细菌素产量的3.6倍。分别采用硫酸铵盐析、有机溶剂沉淀、正丙醇提取、pH吸附几种方法对戊糖乳杆菌C50-6细菌素进行粗分级分离,综合分析后选取效果最好的硫酸铵盐析法。该细菌素的纯化步骤依次为:首先取发酵液离心得去菌体细胞的上清液,再向其中加入硫酸铵固体粉末至饱和度70%,静置过夜,离心取沉淀溶于pH4.5的柠檬酸缓冲液得到细菌素粗提液,用相同的缓冲液进行过夜透析脱盐,再经过SP-Toyopeal-650M阳离子交换色谱纯化,采用含0.1mol/L NaCl的pH4.4的柠檬酸缓冲液洗脱可得细菌素的活性峰,最终细菌素比活提高了39倍,得率为21.8%。经Tricine-SDS-PAGE检测该细菌素的分子量约为2500Da,抑菌实验表明该蛋白条带具有很强的抑菌活性,证实该电泳条带即是细菌素。对细菌素的发酵液和粗提液的特性进行对比研究,发现发酵液在pH2.0-5.0、粗提液在pH2.0-6.0时显示活性;发酵液100℃耐受20min,粗提液具有更高的热稳定性,121℃加热20min后活性无损失;发酵液和粗提液都被木瓜蛋白酶和胰蛋白酶失活,被蛋白酶K部分失活,不被胃蛋白酶失活;发酵液和粗提液具有较一致的抑菌谱,二者均能有效抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等G+和G-细菌、能抑制戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus） G21-10和植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）C21-6等近源乳酸菌、对红酵母（Rhodotorula sp.）和青霉（Penicilliumsp.）也有微弱的抑制作用,细菌素粗提液的效价明显提高,经过排除有机酸干扰后粗提液对G+菌抑制作用更为显著。总之,戊糖乳杆菌C50-6所产细菌素在酸性和中性环境下稳定、对热稳定、能被部分蛋白酶失活、抑菌谱较广,具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。