牙鲆eIF2α激酶基因HRI和PKR的克隆、表达及功能分析

论文摘要

当真核细胞面临各种外界压力时,可通过磷酸化真核翻译起始因子eIF2α的Ser51位点来调节蛋白的合成。目前发现了四种磷酸化eIF2α的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,分别是HRI（the heme-regulated initiation factor 2αkinase）、PKR（the interferon inducible double-stranded RNA dependent protein kinase）、GCN2（the general control nonderepressible 2）和PERK（the endoplasmic reticulum-resident kinase）。本研究通过构建紫外灭活的草鱼出血病病毒（grass carp hemorrhage virus, GCHV）诱导的牙鲆囊胚培养细胞（flounder （Paralichthys olivaceus） embryonic cells,FEC）的SMART cDNA文库,运用同源克隆法,成功克隆鉴定了牙鲆的两个eIF2α激酶基因PoHRI（Paralichthys olivaceus HRI）和PoPKR,表达特征和初步功能分析揭示PoHRI和PoPKR在牙鲆的抗病毒免疫反应中可能发挥翻译抑制功能。PoHRI是成功克隆的第一个鱼类HRI基因,全长cDNA序列为2391bp,编码651aa。结构上,PoHRI与已知HRI蛋白具有高度同源性,C端包含12个保守的eIF2α激酶催化亚区,IV和V区之间有一段长136aa的激酶间区,并具有相对保守的N端区域（NTD）。体外诱导研究表明,热休克、病毒感染和PolyI:C都能诱导FEC细胞中的PoHRI mRNA的上调表达,但不同压力下PoHRI的表达模式不同。原核表达特异于PoHRI的N端1-200氨基酸的融合多肽,免疫小鼠成功获得抗PoHRI抗体血清,western blot分析揭示不同压力下PoHRI蛋白呈现与mRNA一致的上调表达模式。体内研究证明PoHRI在牙鲆组织中是一种遍在表达的激酶,可能不仅仅是一种血红素依赖的eIF2α激酶。人工感染大菱鲆弹状病毒（scophthalmus maximus rhabdovirus,SMRV）发现PoHRI在牙鲆相应组织的表达明显上调。PoHRI的病毒诱导特征暗示其可能在抗病毒免疫反应中发挥蛋白翻译抑制或某种未知功能。PoPKR全长cDNA序列为2596bp,编码688aa。推导的PoPKR蛋白具有哺乳类PKR的保守结构域,包括N端的两个dsRNA结合区（dsRNA-binding motifs,dsRBMs）,dsRBM1和dsRBM2,以及C端由12个保守的催化亚区组成的激酶区。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 eIF2α激酶家族
• 1.1.1 eIF2α激酶的作用机制
• 1.1.2 eIF2α激酶的结构特征
• 1.1.3 eIF2α激酶的调节
• 1.1.4 可能存在的其它eIF2α激酶
• 1.1.5 eIF2α激酶的抑制子
• 1.1.6 eIF2α激酶的其它作用
• 1.2 HRI 基因的研究进展
• 1.2.1 HRI 的结构特点
• 1.2.2 HRI 的调节
• 1.2.2.1 血红素对HRI 的调节
• 1.2.2.2 热休克蛋白对HRI 的调节
• 1.2.3 HRI 的组织分布
• 1.2.4 HRI 的功能
• 1.3 PKR 基因的研究进展
• 1.3.1 PKR 的结构特点
• 1.3.1.1 PKR 的N端
• 1.3.1.2 PKR 的C 端
• 1.3.1.3 中心区－磷酸化区域
• 1.3.1.4 PKR 的启动子
• 1.3.2 PKR 的合成与降解
• 1.3.3 PKR 的功能
• 1.3.3.1 PKR 的抗病毒功能
• 1.3.3.2 PKR 能抑制肿瘤
• 1.3.3.3 PKR 调节细胞增殖和分化
• 1.3.3.4 PKR 在细胞凋亡中的作用
• 1.3.3.5 PKR 在信号转导中的作用
• 1.3.3.6 PKR 在转录调控中的作用
• 1.4 鱼类eIF2α激酶
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 牙鲆
• 2.1.2 细胞和病毒
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 试剂
• 2.3.1 试剂盒
• 2.3.2 主要试剂
• 2.3.2.1 生化与分子生物学试剂
• 2.3.2.2 细胞培养常用试剂
• 2.3.3 载体和菌株
• 2.3.4 引物
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 细胞培养
• 2.4.1.1 细胞培养及传代
• 2.4.1.2 细胞株的保藏
• 2.4.1.3 冻存细胞的复苏
• 2.4.2 病毒增殖、纯化和紫外灭活
• 2.4.2.1 病毒的增殖
• 2.4.2.2 病毒的纯化
• 2.4.2.3 紫外灭活病毒
• 2.4.3 SMART cDNA 的合成
• 2.4.3.1 病毒诱导的FEC 细胞的制备
• 2.4.3.2 病毒诱导和对照FEC 细胞总RNA 的提取
• 2.4.3.3 SMART cDNA 的合成
• 2.4.4 RACE-PCR 克隆全长基因及序列分析
• 2.4.4.1 RACE-PCR 克隆全长基因
• 2.4.4.2 序列分析
• 2.4.5 目的基因的原核表达，纯化及多克隆抗体的制备
• 2.4.5.1 原核表达载体的构建
• 2.4.5.2 小量诱导筛选阳性克隆
• 2.4.5.3 大量诱导
• 2.4.5.4 蛋白的纯化
• 2.4.5.5 多克隆抗体的制备和鉴定
• 2.4.6 RT-PCR 分析
• 2.4.6.1 RNA 的提取
• 2.4.6.2 逆转录
• 2.4.6.3 荧光定量 PCR
• 2.4.7 Western blot 分析基因的表达
• 2.4.7.1 样品的制备
• 2.4.7.2 Western blotting
• 2.4.8 目的基因的表达分析
• 2.4.8.1 目的基因的组织特异性表达分析
• 2.4.8.2 目的基因在FEC 细胞中的诱导表达分析
• 2.4.8.3 目的基因在牙鲆鱼体中的诱导表达分析
• 2.4.9 PolyI:C pull down 分析
• 2.4.9.1 PolyI:C agarose beads 的制备
• 2.4.9.2 PolyI:C pulldown
• 2.4.10 PKR 基因抑制翻译的功能分析
• 2.4.10.1 点突变
• 2.4.10.2 瞬时转染
• 2.4.10.3 萤光素酶活性分析
• 2.4.11 eIF2α的磷酸化分析
• 2.4.11.1 FEC 细胞磷酸化蛋白的提取
• 2.4.11.2 FEC细胞磷酸化蛋白的分析
• 第三章 结果与分析
• 3.1 PoHRI 基因全长cDNA 的克隆及表达分析
• 3.1.1 PoHRI 基因全长cDNA 的克隆
• 3.1.2 PoHRI 基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析
• 3.1.3 PoHRI 基因的原核表达和多克隆抗体的制备
• 3.1.4 PoHRI 基因的组织表达分析
• 3.1.5 PoHRI 基因在各种细胞压力诱导下的表达
• 3.1.6 SMRV 诱导牙鲆鱼体中PoHRI 基因的表达分析
• 3.2 PoPKR 基因全长cDNA的克隆、表达和功能分析
• 3.2.1 PoPKR 基因全长cDNA 的克隆
• 3.2.2 PoPKR 基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列分析
• 3.2.3 PoPKR 基因的原核表达和多克隆抗体的制备
• 3.2.4 病毒和Poly I:C 诱导FEC 细胞PoPKR 基因的表达
• 3.2.5 SMRV 诱导牙鲆鱼体中PoPKR 基因的表达分析
• 3.2.6 PoPKR 和PoHRI 受病毒诱导表达的差异
• 3.2.7 PoPKR 蛋白N 端结构域的dsRNA 结合活性分析
• 3.2.8 PoPKR 抑制翻译的功能分析
• 3.2.9 eIF2α的磷酸化分析
• 第四章 讨论
• 4.1 鱼类存在eIF2α激酶家族
• 4.1.1 鱼类细胞在压力下具有eIF2α磷酸化现象
• 4.1.2 牙鲆HRI 和PKR 基因是哺乳类的同源基因
• 4.2 牙鲆HRI 和PKR 是两种遍在表达的激酶
• 4.2.1 有关HRI的组织分布的争论
• 4.2.2 牙鲆HRI 和PKR 存在本底表达的意义
• 4.3 牙鲆eIF2α激酶功能保守性和特殊性
• 4.3.1 PKR 的各结构域具有类似哺乳类PKR 的功能
• 4.3.2 HRI 在多种压力下的功能
• 4.3.3 PKR 和HRI 在抗病毒免疫中的可能角色
• 4.4 鱼类eIF2α激酶的结构特殊性
• 总结
• 参考文献
• 附录
• 论文发表情况
• 致谢