中华鲟抗菌肽HEPCIDIN的克隆、表达及其抗菌活性分析

论文摘要

hepcidin是一类新颖的小分子抗菌多肽,其不仅具有广谱抗菌活性,还被认为是一种关键的铁代谢调节因子,在鱼类中分布广泛。为有效防治养殖鱼类病毒、细菌（特别是耐药菌）和寄生虫感染的疾病,抗菌肽作为可替代抗生素的药物、饲料免疫添加剂等方面的研究已成为很多研究者关注的热点。本实验根据NCBI/GenBank上已登录鱼类hepcidin序列信息,根据序列的保守性,用Primer 5.0软件设计一对兼并引物（F1,R1）；表达引物（F2,R2）加入酶切位点和终止密码子,在上游表达引物F2中加入EcoR I限制性内切酶酶切位点,在下游表达引物R2中加入NotⅠ限制性内切酶酶切位点。利用RT-PCR方法,从中华鲟血液cDNA文库中克隆抗菌肽hepcidin基因；利用表达引物（F2,R2）对重组质粒进行PCR扩增,目的片段与表达载体pPICZaA都经过限制性内切酶EcoR I和NotⅠ分步双酶切后,T4连接酶16℃连接过夜,转化大肠杆菌TOP10,构建真核重组表达质粒pPICZaA-hepcidin,并送华大基因公司测序鉴定。重组表达质粒pPICZaA-hepcidin通过BstXI单酶切线性化、电泳,纯化回收酶切产物。电转化感受态的毕赤酵母工程菌GS115,转化后涂布含ZeocinTM培养基,筛选具有高抗性的转化子。先用BMGY培养液（含甘油）激活培养约24 h,OD600值达2-6时,收集菌液,换BMMY培养液,在28℃,250 rpm条件下开始甲醇诱导表达。每隔24 h,向锥形瓶中加入终浓度为0.8%的甲醇,并补充适量的无菌水,同时诱导pPICZaA空载体酵母菌。72 h后收集上述甲醇诱导表达后的上清液,用饱和度为85%的硫酸铵浓缩酵母诱导菌表达上清,对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性、抑菌效价和热稳定性测定,初步判断抗菌肽hepcidin的生物活性。结果显示：1、从中华鲟血液cDNA文库中成功克隆了抗菌肽hepcidin基因,目的片段长度为327 bp；成功构建了真核重组表达载体pPICZaA-hepcidin,而且该重组表达蛋白能够体外抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和温和气单胞菌,并对耐药性菌株嗜水气单胞菌也有很好的杀菌效果,但是对枯草芽孢杆菌抑菌效果不明显,对迟缓爱德华氏菌没有抑菌作用。说明本研究成功在毕赤酵母中表达出具有生物活性的hepcidin重组蛋白。2、抑菌结果显示,加入70μL重组抗菌肽hepcidin就可以抑制260μL LB培养基中含有40μL大肠杆菌DH5α的生长,与1μg氨苄青霉素的抑菌效果相当。3、重组抗菌肽hepcidin的热稳定性测定结果显示,重组抗菌肽hepcidin煮沸10min和30 min均有抗菌活性,但是相比未煮沸的重组抗菌肽hepcidin,抗菌活性有所降低；煮沸1 h,重组抗菌肽hepcidin失去抗菌活性。表明该蛋白在预防和治疗鲟科鱼类细菌性疾病方面有潜在的应用价值,诱导表达出具有活性的抗菌肽,并为抗菌肽的应用研究及其大规模生产奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 氨基酸及其缩写
• 第1章 文献综述
• 1 抗菌肽的分类
• 2 抗菌肽的结构与功能
• 2.1 α螺旋型抗菌肽
• 2.2 β折叠型抗菌肽
• 2.3 环状型抗菌肽
• 2.4 线型抗菌肽
• 2.4.1 富含脯氨酸抗菌肽
• 2.4.2 富含甘氨酸抗菌肽
• 3 抗菌肽的生物学功能
• 3.1 具有广谱抗菌活性
• 3.2 具有抗病毒作用
• 3.2.1 HSV
• 3.2.2 HIV
• 3.2.3 IVA
• 3.3 具有抗原虫作用
• 3.4 抗肿瘤活性
• 3.5 免疫佐剂
• 4 鱼类抗菌肽其他方面的研究进展
• 5 抗菌肽基因的表达策略
• 5.1 原核表达系统
• 5.2 真核表达系统
• 5.2.1 哺乳动物细胞表达系统
• 5.2.2 杆状病毒表达系统
• 5.2.3 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 6 本研究的目的,意义及内容
• 第2章 中华鲟抗菌肽hepcidin的克隆、表达及其抗菌活性分析
• 1 材料
• 1.1 实验鱼
• 1.2 菌体与载体
• 1.2 实验试剂
• 1.3 溶液与培养基
• 1.4 实验仪器
• 1.5 引物
• 2 方法
• 2.1 中华鲟hepcidin的PCR扩增、克隆与鉴定
• 2.1.1 实验鱼的处理
• 2.1.2 Trizol法提取总RNA
• 2.1.3 cDNA第一条链的合成及PCR扩增
• 2.1.4 PCR产物回收与纯化
• 2.1.5 目的基因的克隆与筛选
• 2.1.6 重组质粒的PCR鉴定
• 2.1.7 基因序列的测定与分析
• 2.2 重组真核表达载体pPICZαA-hepcidin的构建
• 2.2.1 目的基因的PCR扩增
• 2.2.2 PCR产物回收与纯化
• 2.2.3 目的基因的克隆与筛选
• 2.2.4 重组质粒的鉴定
• 2.2.5 基因序列的测定与分析
• 2.2.6 pMD19-hepcidin质粒与表达载体pPICZαA的分步双酶切
• 2.2.7 目的基因与真核表达载体的连接
• 2.2.8 重组质粒的转化
• 2.2.9 重组真核表达质粒的PCR鉴定
• 2.2.10 测序鉴定与分析
• 2.3 重组真核表达载体在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析
• 2.3.1 重组表达质粒pPICZαA-hepcidin的提取
• 2.3.2 重组质粒的线性化
• 2.3.3 酵母感受态细胞的制备
• 2.3.4 线性化重组质粒电转化酵母感受态细胞
• 2.3.5 阳性酵母菌落的筛选
• 2.3.6 高拷贝阳性菌株的诱导表达
• 2.3.7 体外抑菌实验
• 2.3.8 重组抗菌肽hepcidin的抑菌效价测定
• 2.3.9 重组抗菌肽hepcidin的杀菌效价测定
• 2.3.10 重组抗菌肽hepcidin的热稳定性检测
• 3 结果
• 3.1 中华鲟hepcidin基因的鉴定
• 3.1.1 中华鲟RNA提取结果
• 3.1.2 中华鲟hepcidin基因的RT-PCR结果
• 3.1.3 中华鲟hepcidin基因的菌液PCR鉴定
• 3.1.4 中华鲟hepcidin基因的测序鉴定
• 3.2 中华鲟hepcidin真核表达载体的构建
• 3.2.1 重组表达质粒pPICZαA-hepcidin的双酶切结果
• 3.2.2 重组真核表达质粒的PCR鉴定
• 3.2.3 重组真核表达质粒的测序鉴定
• 3.3 中华鲟hepcidin基因的序列分析
• 3.3.1 中华鲟hepcidin核苷酸序列同源性分析
• 3.3.2 中华鲟hepcidin核苷酸序列构建系统发育树
• 3.3.3 表达载体的构建及测序结果分析
• 3.4 重组质粒pPICZαA-hepcidin的线性化
• 3.5 阳性重组酵母菌落的PCR鉴定
• 3.6 生物学活性检测
• 3.6.1 表达产物抗菌活性检测
• 3.6.2 重组抗菌肽hepcidin的抑菌效价
• 3.6.3 重组抗菌肽hepcidin的杀菌效价
• 3.6.4 重组抗菌肽hepcidin的热稳定性
• 4 讨论
• 4.1 引物设计与载体的选择
• 4.2 EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切位点的选择
• 4.3 目的基因内部结构对表达量的影响
• 4.4 诱导时间、温度和甲醇浓度对酵母表达的影响
• 4.5 重组抗菌肽hepcidin生物活性的测定
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间论文发表情况
• 附录