禽呼肠孤病毒σC基因的克隆表达及其免疫原性初步研究

论文摘要

鸡病毒性关节炎是近年来发现的一种由禽呼肠孤病毒（Avian Reovirus virus,ARV）引起的鸡慢性传染病,以侵害跗关节、趾关节及其肌腱和心肌为特征。该病在世界各地均有发生,对养鸡业带来严重的经济损失。ARVσC蛋白能刺激机体产生保护性中和抗体,具有免疫效果好的特点。本试验应用基因克隆技术进行体外表达σC蛋白并对其进行免疫原性的初步研究。试验采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒（ARV）S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,构建了pMD19T-σC克隆载体,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段大小为1038bp,扩增的目的片段与报道的S1133σC基因的核苷酸序列同源性为98%。将该基因重组至pET32a（+）原核表达载体上成功构建了表达载体pET32a-σC,该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0mM IPTG诱导5小时得到最佳表达。表达重组蛋白的相对分子质量为54KDa,以包涵体形式存在。经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。pET32a-σC重组菌大量诱导表达后的产物用低压液相层析仪进行组氨酸标签的过柱纯化,在100mM咪唑buffer洗脱时蛋白较纯,纯化的蛋白经复性后测得其蛋白含量为150μg/ml。试验动物分为三组,分别为S1133灭活苗组,σC蛋白免疫组和空白对照组,在13、20和35日龄分别采集血清用建立的σC-ELISA方法进行抗体的检测分析,在36日龄时用ARVS1133病毒攻毒,试验结果表明σC蛋白刺激机体产生保护性的中和抗体同商品化S1133全病毒灭活苗的效果大致相当。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 鸡病毒性关节炎发生的历史
• 1.2 病原学
• 1.2.1 病毒的分类及形态结构
• 1.2.2 病毒的理化特性
• 1.2.3 病毒的培养
• 1.2.4 病毒血清型
• 1.3 病毒的基因组和蛋白
• 1.3.1 S1基因及其编码的蛋白
• 1.3.2 S2基因编码的σA蛋白
• 1.3.3 S3基因编码的σB蛋白
• 1.3.4 S4基因编码的σNS蛋白
• 1.3.5 M1基因编码的μA蛋白
• 1.3.6 M2基因编码的μB蛋白
• 1.3.7 M3基因编码的μNS蛋白
• 1.3.8 L1基因编码的λA蛋白
• 1.3.9 L2基因编码的λB蛋白
• 1.3.10 L3基因编码的λC蛋白
• 1.4 流行病学
• 1.4.1 自然宿主
• 1.4.2 传播途径
• 1.4.3 潜伏期
• 1.5 临床症状
• 1.6 病理变化
• 1.7 诊断
• 1.7.1 病毒分离、电镜观察
• 1.7.2 血清学方法
• 1.7.3 分子生物学方法
• 1.8 疫苗研究
• 1.8.1 弱毒苗
• 1.8.2 油乳剂灭活苗
• 1.8.3 ARV σC基因亚单位疫苗
• 1.9 防制
• 2 研究目的意义
• 3 实验材料与方法
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 试验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 ARV σC蛋白基因的扩增
• 3.2.2 重组克隆载体的构建与鉴定
• 3.2.3 原核表达载体pET32a-σC的构建与鉴定
• 3.2.4 重组σC蛋白的表达与鉴定
• 3.2.5 重组σC蛋白的纯化
• 3.2.6 纯化产物的复性
• 3.2.7 重组σC蛋白免疫原性研究
• 4 试验结果
• 4.1 RT-PCR结果
• 4.2 重组质粒pMD19T-σC的鉴定
• 4.3 重组质粒pET32a-σC的鉴定
• 4.4 重组蛋白σC在大肠杆菌中的表达分析
• 4.4.1 重组质粒转化进E.coli BL21（DE3）后的鉴定分析
• 4.4.2 重组蛋白σC的初步表达鉴定
• 4.4.3 重组表达蛋白诱导条件的优化
• 4.4.4 重组表达蛋白的细胞定位分析
• 4.5 重组表达蛋白免疫印迹分析（Western-blotting）
• 4.6 重组σC蛋白的纯化鉴定
• 4.7 重组σC蛋白免疫原性研究
• 50的确定'>4.7.1 ARV ELD₅₀的确定
• 4.7.2 抗体的检测
• 4.7.3 攻毒试验
• 5 讨论
• 5.1 目的基因的选择
• 5.2 σC基因的融合表达
• 5.3 蛋白质的纯化
• 5.4 σC蛋白免疫效果
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录Ⅰ:σC基因序列测序结果
• 附录Ⅱ:试验试剂的配置