BTH诱导橡胶树对白粉病的抗性研究

论文摘要

橡胶白粉病是橡胶的重要病害之一,由橡胶粉孢属（Oidium heveae B. A. Steinm）侵染引起,严重影响橡胶树生长和产量。诱导植物抗性是用生物和非生物因子激发植物的自身免疫力,达到防病的效果。利用诱导植物抗性来防治病虫草害已成为植保技术的新途径。本研究通过盆栽试验,以橡胶品种热研7-33-97和白粉菌为试验材料,对BTH（苯并噻二唑）、PHDC（调环酸钙）、禾甲安和碧护4种诱导剂进行筛选,并选用有效诱导剂BTH对诱导间隔期、诱导次数和诱导抗性相关酶的活性进行了系列试验。同时利用SSH（抑制消减杂交）技术构建了BTH诱导的橡胶抗白粉病的叶片cDNA差减文库,分析BTH诱导后橡胶抗白粉病的基因表达情况,试图从分子水平揭示橡胶的抗病机制,为橡胶抗白粉病的防治和研究提供新方法。研究结果如下：1. BTH、PHDC、禾甲安和碧护4种诱导剂对橡胶白粉病均有一定的防治效果,其中BTH250mg/L和禾甲安500倍液的效果较好,分别为57.8%和51.4%,但BTH显著优于禾甲安和其它处理。2.用BTH 250mg/L处理橡胶芽接苗,不同接种时间间隔实验结果表明,最佳诱导间隔期为5-11天,防治效果在33-57%,持续期至少11d。诱导后,随着接种间隔期的延长,诱导抗病性的效果也在减弱。3. BTH 250mg/L处理并接种病原菌后,POD（过氧化物酶）和PAL（苯丙氨酸解氨酶）的活性比对照显著升高;当酶活性下降至与对照无差异时,进行第2次施药,POD、PAL的活性会再次升高,抗病性增强。4.通过试剂盒RNAiso Reagent法、改良SDS法和改良CTAB-PVP法3种方法对橡胶叶片总RNA的提取进行比较后发现,采用改良SDS法能去除叶片中含有的胶乳,有利于抑制消减杂交文库的构建。5.选用Clontech公司的PCR-select cDNA subtraction kit,构建了BTH诱导的橡胶抗白粉病叶片cDNA文库,并对SSH的各个关键步骤如接头连接效率、消减效率、转化效率等的检测结果显示,差减文库有较高的质量。6.从文库中随机挑取42个阳性克隆进行测序,并在Genbank上对核酸序列比较后发现,在已知功能的核酸序列中,有能量和基础代谢类、信号转导类、膜和转运类和次生代谢类共21条序列和2条重复序列,未知功能的有14条序列,数据库中无显著匹配的有2条序列。BTH通过诱导橡胶树叶片防御相关基因的表达,提高抗性相关酶的活性,有效控制橡胶树白粉病,为橡胶树白粉病防治提供了新的途径,也为进一步研究橡胶树防御基因的表达和信号转导等打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 巴西橡胶树研究概况
• 1.1 橡胶树
• 1.2 天然橡胶
• 1.3 橡胶的种植地位
• 2 橡胶树白粉病研究概况
• 2.1 病原物
• 2.2 症状
• 2.3 发生流行规律
• 2.4 防治措施
• 3 植物诱导抗病性研究概况
• 3.1 概念及其产生
• 3.2 诱导抗病性分类
• 3.3 诱导抗病性的特点
• 3.4 激发子（Elicitor）
• 3.5 植物诱导抗病性的机理
• 4 抑制消减杂交技术在诱导抗病上的应用
• 5 本研究的目的意义
• 第二章 诱导剂的筛选及诱导抗性效果
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 接种菌体的来源
• 1.3 主要设备
• 1.4 供试诱导剂
• 1.5 试剂配制
• 1.6 诱导方法
• 1.7 最佳诱导间隔期与持续期的测定
• 1.8 数据统计分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同诱导剂诱导橡胶抗白粉病的效果
• 2.2 BTH诱发橡胶对白粉病产生抗性的接种病原菌间隔时间
• 3 结论与讨论
• 第三章 BTH诱导橡胶抗白粉病相关酶活性的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 橡胶树品种与栽培条件
• 1.2 供试诱导剂
• 1.3 接种
• 1.4 取样
• 1.5 过氧化物酶（POD）活性测定
• 1.6 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定
• 1.7 数据统计分析方法
• 2 结果与分析
• 2.1 BTH诱导橡胶树叶片后酶的活性变化
• 2.2 BTH再次喷施后各指标酶的活性
• 3 结论与讨论
• 第四章 BTH诱导橡胶对白粉病系统诱导抗性的抑制性消减文库构建
• 1 材料与方法
• 1.1 橡胶树品种与栽培条件
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 方法
• 1.4 总RNA提取与纯化
• 1.5 mRNA的分离
• 1.6 抑制差减杂交
• 1.7 PCR产物的连接及转化
• 1.8 文库重组率检测
• 1.9 PCR法确认载体中插入片段的长度大小
• 1.10 消减文库插入片断的序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同RNA提取方法的浓度及纯度检测
• 2.2 不同方法提取总RNA完整性检测
• 2.3 消减文库的构建
• 2.3.1 Rsa Ⅰ酶解分析
• 2.3.2 接头连接效率检测结果
• 2.3.3 消减cDNA文库消减效率分析
• 2.3.4 两次PCR产物的电泳分析
• 2.3.5 cDNA文库质量评价及测序结果
• 2.3.6 测序结果
• 3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录:SSH技术的原理图
• 发表相关的论文
• 致谢