水稻两个osvdac基因干涉载体的构建及其遗传转化

论文摘要

电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel, VDAC）广泛存在于真菌、植物和动物。VDAC主要在调节线粒体与细胞质之间物质运输和能量调节以及在线粒体介导的细胞凋亡中具有重要作用。在水稻基因组中,已发现至少有8个编码VDAC的基因。本研究采用Gateway重组克隆技术针对其中2个水稻osvdac基因（osvdac3和osvdac5）构建RNA干涉表达载体,遗传转化水稻品种粤泰B和日本晴,探讨这两个基因在水稻中的生理功能。主要的研究结果如下:1.成功构建了水稻基因osvdac3和osvdac5的RNA干涉表达载体osvdac3-1、osvdac3-2、osvdac5-1和osvdac5-2。2. 4个干涉表达载体osvdac3-1、osvdac3-2、osvdac5-1和osvdac5-2分别转化水稻品种粤泰B,仅得到了转干涉表达载体osvdac3-2的转基因阳性水稻植株,并收获了种子。osvdac3干涉的YTB愈伤组织的分化率及转基因苗的阳性率都较低,穗子的结实率也低于野生型粤泰B。3.以干涉表达载体osvdac5-1和osvdac5-2分别转化或共转化水稻品种日本晴,其抗性愈伤组织在分化培养基上均不能分化成苗。实验尝试直接提取愈伤组织的RNA,通过定量PCR分析比较阳性的愈伤组织的osvdac5基因表达量和野生型日本晴愈伤组织中osvdac5基因表达量。结果表明,在转入干涉表达载体osvdac5-1的日本晴愈伤组织中,osvdac5基因的表达量远低于野生型日本晴愈伤组织。尽管转化实验干涉osvdac5基因的表达是成功的,但干涉osvdac5基因表达是否是导致其愈伤组织不能分化成苗的原因尚待进一步验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 VDAC
• 1.1.1 VDAC 的结构
• 1.1.2 VDAC 相关的遗传学信息
• 1.1.3 VDAC 在线粒体以外地方的定位
• 1.1.4 VDAC 的沉默和超表达与细胞的影响
• 1.1.5 植物VDAC
• 1.2 RNA 干涉技术
• 1.2.1 RNA 干涉现象的发现
• 1.2.2 RNA 干涉的作用机制
• 1.2.3 RNAi 的应用
• 1.2.4 RNAi 的特点
• 1.3 Gateway 技术
• 1.4 本研究的主要内容、目的及意义
• 第二章 两个osvdac 基因RNAi 表达载体的构建
• 2.1 前言
• 2.2 材料和试剂
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 RNAi 引物的设计
• 2.3.2 总RNA 的提取
• 2.3.3 RNA 样品的DNase I 处理
• 2.3.4 cDNA 的合成
• 2.3.5 干涉表达载体的构建
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 attB-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.2 BP 反应后阳性克隆的检测
• 2.4.3 LR 反应后表达载体的阳性克隆检测
• 2.5 讨论
• 第三章 osvdac3 和osvdac5 干涉表达载体对水稻的遗传转化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与试剂
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 水稻愈伤组织的诱导
• 3.3.2 愈伤组织的继代
• 3.3.3 含有干涉载体的农杆菌EHA105 的活化
• 3.3.4 农杆菌的侵染与共培养
• 3.3.5 筛选培养
• 3.3.6 筛选继代培养
• 3.3.7 分化培养
• 3.3.8 生根培养
• 3.3.9 炼苗
• 3.3.10 温室培养
• 3.3.11 转基因植株的阳性鉴定
• 3.3.12 日本晴愈伤组织的定量PCR 鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 干涉载体对水稻YTB 的遗传转化
• 3.4.2 干涉载体对水稻日本晴进行遗传转化的结果
• 3.5 讨论
• 参考文献
• 致谢