药用植物天麻Gastrodia elta B1遗传多样性及化学成分的初步研究

论文摘要

天麻（Gastrodia elata B1）是兰科（Orchidaceae）多年生共生草本植物，广泛分布于我国吉林和辽宁东部、内蒙古、河南西北部、云南、四川、贵州、西北等地，在日本、韩国、尼泊尔、不丹也有广泛分布，主要生长于海拔400-3200米的疏林下、林中空地、林缘和灌丛边缘，是中国传统的名贵中药。实验证明天麻素是天麻的主要活性成分之一。本研究运用AFLP和ISSR分子标记对不同分布区天麻遗传多样性和居群的遗传结构进行分析，为天麻资源合理保护利用及优良种质资源的选育奠定基础。同时，运用HPLC等方法对不同产地天麻中的天麻素及无机元素含量进行比较；运用GC-MS分析了天麻的挥发性成分。主要结果如下：在AFLP研究中，从贵州、云南、四川、陕西和辽宁收集了27份天麻样品，从64对AFLP选择性引物组合中筛选出16对引物组合，对不同分布区天麻及天麻不同变型的遗传多样性进行分析。16对引物共产生548条大小在100-2500bp的谱带，其中多态性带428条，多态性比率（PP）达78％。该结果说明天麻中存在较为丰富的遗传多样性，且AFLP可以有效地进行天麻遗传多样性的分析。遗传差异分析结果表明，27个样品的遗传距离在0.54～0.018之间，平均为0.2199，表明不同分布区天麻个体间存在一定的遗传差异。四个省区的样品中来自贵州的样品遗传差异相对较大，遗传距离最大的是大方（6号）与施秉（8号）之间，其遗传距离为0.5934，遗传距离最小的是桐梓（11号）与梵净山（10号）之间，其遗传距离为0.0338。表明贵州蕴藏着相对丰富的基因资源，因而可以作为天麻遗传改良的重要种质资源。对同一来源不同变型的天麻的AFLP分析结果表明，天麻种内的变型仅仅是表型上的变异，遗传距离在0.0224～0.0570之间，表现出较小的遗传差异，这表明分类学上的几种变型仅仅是表型上的变异，没有在分子水平上发生的根本变异。这可能是同一基因型由于环境条件的改变在表型上发生的变化，尚未在遗传上固定下来。对天麻几个变型的划分是否成立还有待进一步研究。把包括海拔高度、经度、纬度、年均降雨量和年均气温在内的环境因子划分为不同的范围，用POPGEN软件分别分析不同环境因子范围下天麻居群的遗传多样性，结果表明处于不同环境因子下的天麻呈现出遗传多样性一定的差异，但遗传样性与上述环境因子的之间并无明显的相关性。环境因子对天麻群体间产生的遗传变异仅占总变异的9.47％至26.41％，而73.59％～90.53％的变异来自于各居群内。利用ISSR（inte-simple sequence repeat）分子标记技术，对分布于贵州（Gastrodia elata B1．）9个居群的天麻遗传多样性水平和遗传结构进行分析。12条ISSR引物共扩增出120条大小在200bp-1600bp清晰的谱带，其中97条具有多态性，总的多态位点百分率为80.83％，表明在物种水平上有较高的遗传变异。居群水平的多态性相对较低，多态百分率在17.5％～40.83％之间，平均25.56％。用POPGENE软件计算各居群间和居群内的遗传参数，结果表明：物种水平上的Nei’s遗传多样性（HE）为0.042-0.153，平均0.073。Shannon信息指数为0.3326±0.2241。Nei’s基因分化系数（Gst）为0.6377，表明居群间的遗传变异占总变异的63.77％，而居群内的遗传变异占总变异的36.33％，这与有限的基因流有关。天麻居群间的基因流较为有限（Nm=0.2841），明显低于异花传粉植物的平均值，这表明天麻的基因流不足。种子生活力低可能降低了因种子传播而产生的基因流。加之，传播出去的天麻种子需要吸收小菇属真菌的营养才能萌发菌，这也造成天麻居群间较低的基因流动。基因流不足和种子的传播距离、种子极低的生活率以及居群间的地理隔离和营养繁殖等因素可能是导致天麻居群遗传分化的主要原因。在不同产地天麻和无机元素含量的比较研究中，从14个不同分布区采集了17个野生和栽培的天麻样本，采用药典天麻素的提取方法，提取天麻素，并采用高效液相色谱法对其含量进行了测定。并比较各产地栽培和野生天麻中主要药用成分天麻素的含量。结果表明，14个分布区的17个天麻样品天麻素含量在0.1603％到2.5513％之间。野生天麻中的天麻素含量明显高于栽培天麻，野生天麻的天麻素平均含量为1.702％，而栽培天麻的天麻素平均含量为0.576％。同一产地的野生和栽培天麻其天麻素的含量也有差异，说明良好的栽培措施有利于天麻素的提高，而不同生长环境也是影响天麻素的含量的重要因素。实验结果也显示，野生天麻和人工栽培天麻的天麻素含量都超过《中国药典》的标准，符合国家用药标准。此外，本研究还对天麻中的N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn以及重金属元素Pb、Cd的含量进行测定，以便为天麻的质量评估提供依据。结果表明，N的含量在4.63-14.52g／kg，磷的含量平均为1.11g／kg，铁的含量差异最大，重金属元素铝和镉的含量在0.24-1.73 mg／kg和0.19-0.80mg／kg。SPSS软件多因子相关性分析结果表明，11种元素中与天麻素含量相关性较为明显的元素是氮元素（r=0.632420；p=0.085643），其余元素含量与天麻素的含量无相关性。运用水蒸汽蒸馏法首次从天麻次生块茎（箭麻）中提取挥发性成分，并用气相色谱质谱法（GC-MS）对化学成分进行分离鉴定，并用面积归一化计算各成分相对含量。杯碟法进行抑菌实验。结果显示：从红天麻中共有42个成分，其中已知成分有14种，其质量占总质量的63.189％。绿天麻共有48个成份，确定成分的有29种，质量占总质量的84.313％。乌天麻有36个成份，20种成分已确定，占76.392％。红天麻中的主要成分是2，3，5，6-四甲基吡嗪（25.331％）、2-戊基呋喃（11.974％）和E，E-2，4-癸二烯醛（8.66％）。绿天麻挥发油的主要成分是亚油酸乙酯（15.444％）、苯乙烯（10.352％）和棕榈酸乙酯（10.066％）。乌天麻中主要包括4-甲基-苯酚（20.409％）、苯乙烯（12.607％）、1-甲乙醚十六烷酸（8.842％）。比较三种天麻的挥发油成分，有6种共有成分，这6种共有成分可以作为鉴定天麻的化学指纹成分。而其它组成和含量都有较大差异。用乌天麻进行的抗菌试验表明：乌天麻挥发性成分对包括米曲霉、黄曲霉、青霉、小麦纹枯病和茶轮斑病在内的部分植物病源真菌有一定的抑菌活性。为天麻挥发油进一步开发利用提供了初步的实验基础。

论文目录

• 图片目录
• 表格目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 天麻不同分布区和不同变型的AFLP分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 仪器与试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 天麻基因组DNA的提取及检测
• 1.3.2 AFLP反应体系优化及扩增程序
• 1.3.3 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
• 1.4 数据统计
• 1.4.1 遗传多样性分析
• 1.4.2 Mantel相关性检测
• 1.4.3 天麻不同变型的遗传多样性分析
• 1.4.4 环境因子对天麻遗传多样性影响的分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 AFLP实验条件优化
• 2.1.1 模板DNA质量与浓度的影响
• 2.1.2 酶切时间的影响
• 2.1.3 预扩增反应的影响
• 2.1.4 选择性扩增的影响
• 2.1.5 选择性扩增体系的建立
• 2.1.6 选择性扩增引物的筛选
• 2.2 AFLP遗传多样性分析
• 2.2.1 样品AFLP多态性及扩增效率
• 2.2.2 样品遗传差异分析
• 2.2.3 不同分布区天麻的UPGMA聚类分析
• 2.3 天麻不同变型的遗传多样性分析
• 2.4 生态因子对天麻遗传多样性及遗传分化的影响
• 2.4.1 生态因子与天麻遗传多样性的关系
• 2.4.2 环境因子对遗传分化的影响
• 3. 讨论
• 3.1 天麻的遗传多样性
• 3.2 不同天麻变型的差异
• 3.3 环境因子对天麻遗传多样性的影响
• 小结
• 参考文献
• 第二章 天麻ISSR遗传多样性的分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 天麻DNA的提取
• 1.2.2 ISSR扩增反应
• 1.2.3 ISSR之扩增产物检测
• 1.2.4 数据统计分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 天麻ISSR体系的建立
• 2.2 ISSR引物的筛选和扩增效率
• 2.3 ISSR遗传多样性分析
• 2.4 居群间的遗传变异分析
• 2.5 天麻居群间的聚类分析
• 3. 讨论
• 3.1 天麻ISSR反应体系的优化
• 3.2 天麻的遗传多样性
• 3.3 天麻的遗传结构
• 3.4 天麻种质资源的保护和利用
• 小结
• 参考文献
• 第三章 不同产地天麻中天麻素和微量元素含量的比较
• 1. 材料、仪器与方法
• 1.1 实验材料及样品处理
• 1.2 仪器、试剂
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 天麻素的定量测定
• 1.3.2 无机元素的测定
• 1.3.3 数据的统计分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 色谱条件
• 2.2 天麻素标准曲线、进样精密度、重复性及回收率试验
• 2.3 不同产地天麻中天麻素的含量
• 2.4 不同产地天麻中无机元素的含量
• 2.5 天麻素与无机元素相关性性分析
• 3. 讨论
• 3.1 不同产地天麻中天麻素含量的比较
• 3.2 不同产地天麻中无机元素含量的分析
• 小结
• 参考文献
• 第四章 天麻挥发性成分分析及抗菌活性研究
• 1. 材料、仪器与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器、试剂
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 挥发性成分的提取
• 1.3.2 GC-MS分析条件
• 1.3.3 体外抑菌实验
• 1.4 结果与分析
• 1.4.1 红天麻、绿天麻和乌天麻的挥发性成分种类及含量
• 1.4.2 三种天麻变型的挥发性已知成分的比较
• 1.4.3 天麻挥发性油的抑菌作用
• 1.5 结果讨论
• 1.5.1 三种天麻挥发性成分的比较
• 1.5.2 天麻挥发性成分的抗菌活性
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 第五章 天麻的研究概况及分子生物学在药用植物研究中的应用
• 1、天麻的研究概况
• 1.1 天麻原植物及本草考证
• 1.2 天麻的生活史及生物学特性的研究
• 1.2.1 天麻的生活史
• 1.2.2 天麻与共生菌的关系
• 1.3 天麻栽培技术
• 1.3.1 天麻无性繁殖技术
• 1.3.2 天麻有性性繁殖技术
• 1.4 天麻化学成分
• 1.4.1 酚类化合物及其贰类
• 1.4.2 甾醇及有机酸类
• 1.4.3 糖类
• 1.4.4 含氮化合物等其他物质
• 1.4.5 天麻化学成分的含量变化
• 1.5 天麻的药理作用
• 1.5.1 对神经细胞损伤的保护作用
• 1.5.2 对中枢神经系统的作用
• 1.5.3 天麻对心血管系统的作用
• 1.5.4 天麻的抗炎、免疫作用
• 1.5.5 促智、抗衰老作用
• 1.5.6 其他药理作用
• 1.5.7 天麻的毒副作用
• 1.6 天麻分子生物学及基因工程等方面的研究
• 1.6.1 天麻抗真菌蛋白
• 1.6.2 天麻抗真菌蛋白的基因克隆及表达
• 1.6.3 基因工程和分子标记的运用
• 1.7 展望
• 2. 分子标记在药用植物研究中的应用
• 2.1 分子标记的发展
• 2.1.1 制性片段长度多态性
• 2.1.2 随机扩增多态性DNA
• 2.1.3 扩增片段长度多态性
• 2.1.4 微卫星（简称SSR）
• 2.1.5 简单序列重复间区（ISSR）
• 2.1.6 DNA序列分析
• 2.2 分子生物学标记在药用植物资源研究中的应用
• 2.2.1 药用植物资源的亲缘进化关系
• 2.2.2 在药材道地性鉴定方面的应用
• 2.2.3 混淆生药品种及近缘生药品种的鉴定
• 2.2.4 药用植物遗传多样性研究
• 2.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表与待发表的论文