论文摘要
目的将大鼠雪旺细胞在体外分离培养、纯化扩增后,移植入大鼠急性脊髓损伤动物模型的损伤部位,并联合应用硫酸软骨素酶进行治疗,通过对脊髓损伤恢复情况行为学和组织学等的评价,并与单一方法应用组和对照组进行比较,探讨硫酸软骨素酶联合雪旺细胞移植在治疗脊髓损伤中的作用,评价该方法的疗效。方法将大鼠坐骨神经手术切断行预变性处理,1周后通过手术分离大鼠坐骨神经获得雪旺细胞,在体外利用植块法进行培养,并利用差速贴壁法进行纯化,传代和扩增。80只健康成年Wistar大鼠随机分成四组,分别为对照组（Control组,A组）、单纯雪旺细胞移植组（SCs组,B组）、单纯硫酸软骨素酶应用组（ChABC组,C组）和硫酸软骨素酶联合雪旺细胞移植组（SCs+ChABC组,D组）。四组动物分别利用Impactor model II型脊髓打击器背侧打击法制造大鼠T10节段急性脊髓损伤动物模型。造模成功后,C组和D组动物分别即刻在局部蛛网膜下注射6μl的ChABC （1U/ml）,而A组和B组给予等量的生理盐水；C组和D组动物分别于术后隔日（第3天、第5天）两次采取尾静脉给药,每只动物注射12μl的ChABC, A组和B组则给予等量的生理盐水；术后1周,B组和D组实验动物取原手术入路显露脊髓损伤处硬膜,用微量注射器在损伤部位垂直刺入损伤中心,注入雪旺细胞悬液10μl（1-1.5×107个细胞/ml）,并分别于损伤中心的头尾斜角45度各注入10μl,同时C组和D组再次给予软骨素酶6μl,而A组则各注入等量DMEM和生理盐水。术后认真护理,并于术前1天、术后1天、3天,术后1周以及以后的每周对实验动物进行脊髓运动功能评分（BBB法）。12周后每组随机选择5只动物进行10%BDA神经顺行示踪标记,标记2周后（术后14周）处死动物。取出动物损伤段脊髓作5μm快速冰冻切片后,进行Cy3荧光染色、HE染色及NF-200免疫组化染色。免疫组化切片染色用图像分析软件Image-pro Plus 5.0分析处理。各种统计学处理采用统计软件SPSS 13.0进行分析。结果预变性处理神经雪旺细胞培养细胞长势明显好于未处理的神经,扩增速度快,经分离纯化后在体外稳定传代,生长状态良好。脊髓损伤实验动物术后4周以后BBB行为功能评分实验组较对照组功能明显恢复,各组之间差异有统计学意义（ANOVA检验,P<0.05）,尤以联合移植组评分与其他各组评分比较有显著性差异（P<0.05）。HE染色显示联合治疗组空洞和瘢痕较对照组少；BDA示踪显示联合治疗组较空白对照组有较多的神经纤维穿过缺损部位。NF-200免疫组化染色密度比较各组之间有显著性差异（P<0.05）,联合治疗组显著高于其他各组。结论周围神经预变性处理可以使体外培养雪旺细胞快速扩增,并且具有高活性；这一方法还能为自体细胞移植提供细胞来源保证。雪旺细胞能分泌多种神经营养因子和细胞外基质,并且具有细胞桥接和空洞充填等作用；通过雪旺细胞移植治疗脊髓损伤,有助于轴突再生,促进损伤动物脊髓功能的恢复。硫酸软骨素酶ABC能降解胶质瘢痕中主要的抑制分子CSPGs,改善脊髓损伤后局部轴突再生的抑制性微环境,能促进轴突再生和功能恢复。联合应用硫酸软骨素酶和雪旺细胞移植来治疗脊髓损伤,起到协同的作用,其效果明显好于单纯应用其中一种方法。由于脊髓损伤后的病理过程非常复杂,多种方法联合应用可以从不同的方面帮助轴突再生,因而联合治疗应该成为脊髓损伤治疗的趋势。