抑制消减杂交技术筛选AM真菌与紫穗槐共生相关基因

论文摘要

丛枝菌根真菌(AMF)是一类广泛存在的与宿主植物进行互利共生的真菌,共生双方双向转运营养成分,克服各种生物与非生物胁迫。AMY与植物共生是一个精细的分子调控过程,从预共生时期的信号对话,到共生阶段的胁迫防御、细胞形态重塑,每一步都有大量生物分子参与。不同于传统模式植物百脉根和苜蓿,本研究选用木本豆科植物紫穗槐作为AM真菌的宿主植物,可能有不同的分子机制,从转录水平筛选AMF与紫穗槐共生相关基因。本文盆栽接种摩西球囊霉(Glomus mosseae, syn Funneliformis mossea)和未接种的紫穗槐,采用一种最近发展起来的简便、成本低廉、低毒的醋酸墨水染色法对紫穗槐根系进行侵染情况检测,发现对紫穗槐菌根染色效果并不亚于经典的酸性品红染色法,并且在400倍显微镜下可以观察到丛枝结构。通过酸性品红染色,发现根内真菌泡囊可发育成内生孢子,染色清晰。然后利用抑制消减杂交技术筛选AMF在定植紫穗槐的过程中紫穗槐差异表达基因,一共获得47个unigenes,其中35个获得显著匹配的。利用GO分类信息,Blast注释信息和相关文献信息,对35个获得显著匹配的unigenes进行基因功能分类,可以被分为八类,分别是：防御胁迫(24%)、代谢(17%)、能量(14%)、蛋白合成(11%)、信号转导(11%)、细胞结构(11%)、转录(6%)、蛋白折叠和降解(6%)。其中,胁迫防御相关基因和代谢相关基因所占比例最大。这些发现暗示胁迫防御相关基因和代谢相关基因在AMF和紫穗槐共生互做过程中发挥着重要的作用。最后用Transeq,ProtParam,ProtScale和Sopma等工具对未知序列编码肽段的一级氨基酸序列,肽段理化特性和二级结构进行预测。这些未知序列编码的肽段大多数不稳定,偏碱性,不同程度地含有α螺旋,p折叠,转角和卷曲,有的预测肽段可能定位于膜上,但是大多数应该在细胞质中发挥功能。AMF与紫穗槐共生的过程是一个系统涉及各种生物过程的活动,有机体各方面功能域协调系统工作最终完成AMF与紫穗槐的共生,以便营养交换。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 丛枝菌根概述
• 1.1.1 菌根
• 1.1.2 丛枝菌根真菌
• 1.1.3 丛枝菌根真菌的功能
• 1.2 丛枝菌根真菌的生态学地位
• 1.2.1 AMF与植物生态学
• 1.2.2 AMF与环境
• 1.2.3 生态修复
• 1.2.4 AMF与碳循环
• 1.2.5 AMF与生态系统
• 1.3 丛枝菌根与植物共生过程和稳定性机制
• 1.3.1 丛枝菌根与植物共生过程
• 1.3.2 AMF与植物共生的稳定机制
• 1.4 豆科木本植物紫穗槐
• 1.5 差异基因研究技术
• 1.5.1 几种差异基因筛选技术
• 1.6 试验目的意义与技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌种及植株
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂配置方法
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 材料培养
• 2.2.2 侵染情况检测
• 2.2.3 紫穗槐根总RNA提取
• 2.2.4 总RNA完整性和纯度检测
• 2.2.5 紫穗槐根系总mRNA纯化
• 2.2.6 紫穗槐丛枝菌根相关基因的抑制消减杂交
• 2.2.7 杂交PCR产物纯化
• 2.2.8 PCR产物的克隆
• 2.2.9 差异基因的反向Northern Blot杂交验证
• 2.2.10 SSH库的测序
• 2.2.11 unigenes序列的功能注释
• 第3章 试验结果与分析
• 3.1 紫穗槐培养和侵染情况检测
• 3.2 总RNA完整性和纯度检测
• 3.3 紫穗槐丛枝菌根相关基因的抑制消减杂交
• 3.3.1 反转录以及酶切效果检测
• 3.3.2 消减产物的PCR扩增
• 3.4 紫穗槐抑制消减cDNA文库的构建和插入片段的PCR鉴定
• 3.5 差异基因的反向Northern Blot杂交验证
• 3.6 序列测定和基因的功能注释
• 3.7 已知共生相关基因的功能分类
• 3.8 未知基因序列编码肽段的预测分析
• 第4章 讨论
• 4.0 材料培养和菌根真菌侵染情况
• 4.1 RNA提取
• 4.2 抑制消减杂交技术
• 4.3 AMF与紫穗槐共生相关基因
• 4.3.1 AMF与紫穗槐共生相关基因
• 4.3.2 对未知序列编码肽段的预测
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文