苎麻纤维天然处理体系的微生态解析

论文摘要

苎麻生物脱胶是一种绿色环保的脱胶方法,相比传统化学脱胶法,生物脱胶具有提高精干麻质量,不损伤纤维,无污染等优点。本实验涉及两条研究路线,即微生物培养法和宏基因组学研究法,两者相互补,促进对环境生态体系中未知微生物的了解,有助于构建高效的脱胶体系。传统的微生物培养法,以腐烂苎麻为研究对象,将富集培养与稀释涂布相结合从随机选取的几种腐烂苎麻样品中获得微生物纯培养38株,以形态学观察、生理生化测定和16S rRNA聚类分析对细菌进行鉴定。利用透明圈法筛选得到脱胶能力相对较高的微生物9株,其中细菌6株,分别隶属于芽孢杆菌属（Bacillus）1株、不动杆菌属（Acinetobacter）2株,类芽孢杆菌属（Paenibacillus）2株,伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）1株;丝状真菌3株分别为白曲霉群的白曲霉（Aspergillus candidus）,米黄曲霉群的米曲霉（Aspergillusoryzae）和不对称青霉组的桔青霉（Penicilluium citrinum）。以残胶率为标准,比较6株细菌综合脱胶能力,其中的枯草芽孢杆菌A5（Bacillus subtilis）A5脱胶能力最强,残胶率为13.82%。采用正交实验与响应面分析相结合的应用统计学分析法优化实验室自行从腐烂苎麻中分离的菌株Bacillus subtilis A5的脱胶工艺条件,并验证其可靠性。结果表明,该菌种所产脱胶酶系的果胶酶活力、木聚糖酶活力较高,没有纤维素酶活力。较适宜的脱胶发酵条件为:pH值8.5,发酵时间96h,温度40℃,接种量5%,转速205rpm,残胶率为10.61%,比未优化前减少了23.23%,有效降低了残胶率,提高了脱胶效果。经Bacillus subtilis A5生物脱胶处理后的苎麻纤维,线密度6.47dtex,断裂强力46.50cN,断裂伸长率5.13%,断裂强度7.19cN/dtex,纤维损伤较小,保证了苎麻纤维品质。生物脱胶处理过的纤维再经稀碱处理,残胶率达到1.35%,符合纺纱的工艺要求。Bacillus subtilis A5苎麻脱胶工艺条件的研究,为进一步研究其对苎麻的生物-化学联合脱胶及纯生物脱胶提供了理论基础。研究发现,仅依靠微生物培养法评估研究体系中微生物种群的多样性具有局限性。宏基因组学研究法,直接从环境样品中提取微生物群体基因组DNA从而绕过传统微生物研究法所必需的培养阶段对其进行研究。本实验设计对比了6种苎麻园土壤DNA的提取方法,均能提取到分子量23kb左右的DNA片段,但不同方法方法取得的DNA的片段长度,产量和纯度存在明显差异。其中,Ⅴ法提取出DNA的量最多179.75±0.49μg/g干土,方法Ⅳ提取的DNA片段最大达到48kb左右,方法Ⅰ法提取的DNA纯度最高,方法Ⅲ法提取的DNA的完整性最好。试验所提取的土壤总DNA不需要纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16S rDNA基因的引物可以扩增得到相应的片断。为研究土壤微生物群落结构的分子生态学提供高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA奠定了基础。从苎麻园土壤样品中提取未培养细菌的总DNA,用pCC2FOSVector为载体构建获得5×104个克隆的Fosmid文库,文库中外源DNA总容量约为1.8×106kb,利用果胶酶活性和木聚糖酶活性进行过功能性筛选,获得18个表达果胶酶活性或木聚糖酶活性的阳性克隆子。为阐明果胶酶和木聚糖酶的脱胶的机理和在脱胶体系中的作用、以及进一步探索果胶酶和木聚糖酶的简便高效的生产方法奠定了基础,具有重要的理论意义和现实意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 苎麻的化学成分及其特点
• 1.2.1 苎麻的化学成分
• 1.2.2 苎麻纤维的特点
• 1.3 苎麻脱胶方法及其原理介绍
• 1.3.1 苎麻纺织工业脱胶方法
• 1.3.2 苎麻生物脱胶方法
• 1.4 苎麻生物脱胶相关酶类简介
• 1.4.1 果胶酶
• 1.4.2 半纤维素酶
• 1.4.3 木质素降解酶
• 1.5 宏基因组文库技术在开发未培养环境微生物基因资源中的应用
• 1.5.1 用传统培养方法研究环境微生物中活性物质的局限性
• 1.5.2 宏基因组克隆—微生物活性物质筛选的新途径
• 1.5.3 宏基因组克隆筛选生物活性物质研究概况
• 1.5.4 宏基因组文库的构建
• 1.6 我国苎麻纺织行业的发展
• 1.7 苎麻生物脱胶的国内外研究进展
• 第2章 苎麻脱胶优势菌株的分离、筛选和鉴定
• 2.1 材料、试剂和设备
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 富集培养
• 2.2.2 初筛
• 2.2.3 复筛
• 2.2.4 菌种鉴定
• 2.2.5 系统发育分析
• 2.2.6 胞外酶活力测定
• 2.2.7 脱胶效果的评价
• 2.3 结果
• 2.3.1 初筛结果
• 2.3.2 复筛结果
• 2.3.3 微观形态观察及鉴定结果
• 2.3.4 系统发育分析
• 2.3.5 脱胶菌株的选择及酶活力分析
• 2.3.6 六株具有较强脱胶能力的细菌脱胶效果评价
• 2.4 结论
• 第3章 应用统计学原理优化BACILLUS SUBTILIS A5的脱胶条件和纤维性能评价
• 3.1 材料、试剂和分析工具
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂及培养基配制
• 3.1.3 主要仪器及设备
• 3.1.4 分析工具
• 3.2 方法
• 3.2.1 制备种子液
• 3.2.2 微生物脱胶
• 3.2.3 正交试验
• 3.2.4 响应面试验
• 3.2.5 苎麻化学成分分析
• 3.2.6 苎麻纤维脱胶前后变化情况
• 3.2.7 脱胶苎麻物理性能及纤维品质鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 正交试验结果分析
• 3.3.2 响应面试验结果分析
• 3.3.3 苎麻化学成分分析
• 3.3.4 苎麻纤维脱胶前后变化情况
• 3.3.5 脱胶苎麻物理性能及纤维品质鉴定
• 3.4 结论
• 第4章 苎麻园土壤宏基因组文库构建
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 酶和试剂
• 4.1.3 主要试剂及培养基配方
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 土壤样品预处理
• 4.2.2 土壤DNA提取
• 4.2.3 DNA质量检测
• 4.2.4 宏基因组文库的构建
• 4.2.5 质粒提取和酶切分析
• 4.2.6 功能性筛选
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 六种方法提取土壤总DNA凝胶电泳结果
• 4.3.2 DNA浓度和纯度测定
• 4.3.3 土壤DNA中16S rDNA基因的PCR扩增结果
• 4.3.4 宏基因组文库构建
• 4.3.5 质粒提取
• 4.3.6 酶切分析
• 4.3.7 功能性筛选结果
• 4.4 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学位论文及专利申请
• 附录