鸭圆环病毒cap基因的表达与检测CAP抗体的间接ELISA方法建立

论文摘要

鸭圆环病毒（duck circovirus，DuCV）是圆环病毒科圆环病毒属的成员之一，主要引起宿主的淋巴系统损伤，导致免疫抑制，进而引起继发感染或二重及多重感染，已引起越来越多的关注。美国、匈牙利、德国和中国台湾等地区相继报道在番鸭、半番鸭、樱桃谷肉鸭中发现该病毒。国内福建、山东、浙江和广州等省份的流行病学调查，也证实了DuCV的普遍存在。DuCVcap蛋白是DuCV的主要的免疫原性蛋白，也是病毒的主要结构蛋白。为了能够得到DuCV的免疫原性蛋白，并以此建立诊断方法，为鸭场大规模样品中检测DuCV抗体提供依据。研究用DuCVcap基因原核表达蛋白，并进行纯化，建立间接ELISA方法，初步应用于安徽省部分鸭场DuCV抗体检测。具体如下：首先利用软件对DuCVAQ0901株cap基因的保守区域进行分析，设计了一条特异性引物，将N末端影响外源蛋白表达的稀有密码子截去后，将其克隆到原核表达载体PET-28a中，并在完成对构建质粒PCR、EcoR Ⅰ/SalⅠ双酶切鉴定，测序鉴定后，用诱导剂IPTG对其进行诱导表达，同时对诱导剂浓度，诱导时间，蛋白表达的可溶性等条件进行优化。在大量表达重组dcap蛋白后，利用NI纯化树脂对His-dcap蛋白进行纯化，同时还对重组蛋白的浓度，纯度以及免疫活性等特性进行检测，并用纯化好蛋白免疫健康樱桃谷肉鸭，制备了多克隆抗体血清。结果显示，构建好的pET-28a-dcap重组质粒诱导表达后，经SDS-PAGE检测及Western-blot分析证明，在大肠杆菌中得到了高效表达，并以包涵体的形式表达；用NI纯化树脂对His-dcap蛋白进行纯化后，蛋白浓度可达1.285mg/mL，且表达蛋白保留了部分天然cap蛋白的抗原性；利用纯化蛋白乳化后制备多克隆抗体血清经琼扩试验测定抗体效价可达1∶128。其次利用上述纯化好dcap蛋白建立一种检测cap抗体的间接ELISA方法，为规模化鸭场DuCV感染情况调查提供快速简易的血清学方法。即利用纯化好的蛋白（dcap）作为包被抗原，制备cap抗体阴阳性血清，用矩阵法筛选最佳工作浓度，同时也对抗原包被时间、一抗孵育时间、二抗反应时间、底物显色时间等条件优化确定，计算出阴阳性血清临界值及结果判定方法。并用此方法对安徽省部分鸭场采集血清进行了DuCV抗体检测。用纯化cap蛋白包被酶标板，建立特异性检测cap抗体的间接ELISA方法。确定该方法蛋白最佳包被量为6.57μg/mL，血清最佳稀释度为l∶80，阴阳性临界值为0.391。抗原最佳包被时间为4℃过夜，一抗孵育、二抗反应、底物显色最佳时间分别为1h，1h，15min。并用建立的间接ELISA方法，对安徽部分地区收集的338份鸭血清样品进行cap抗体检测，结果检出阳性率为26.9％，证明了安徽部分地区鸭场中DuCV的感染普遍存在。用生物统计学方法对结果进行分析，显示安徽省部分地区鸭群中以樱桃谷肉鸭的DuCV感染率较高；不同日龄段的鸭群中DuCV的感染情况，以30-60日龄段高于其它日龄段；不同地区间DuCV阳性检出率也存在着一定程度的差异。上述结果证实建立的间接ELISA方法可用于大规模样品的临床检测，为鸭圆环病毒病流行病学的调查和下一步ELISA检测试剂盒的开发奠定了基础，对鸭圆环病毒病的诊断与疫苗的研究有较大的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 鸡传染性贫血病毒
• 2 猪圆环病毒
• 3 鸭圆环病毒
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 载体、菌种与实验动物
• 1.2 主要试剂与器材
• 1.2.1 主要试剂
• 1.2.2 主要器材
• 1.3 主要试剂配制
• 1.3.1 核酸电泳试剂
• 1.3.2 感受态细胞制备试剂
• 1.3.3 原核表达所需试剂
• 1.3.4 蛋白质电泳试剂
• 1.3.5 蛋白提取、纯化溶液
• 1.3.6 Western blotting 试剂
• 1.3.7 ELISA 试剂配制
• 1.4 DuCV dcap 基因的克隆
• 1.4.1 引物设计
• 1.4.2 病毒基因组 DNA 的扩增及纯化
• 1.4.3 重组质粒的构建
• 1.5 pET-28a-dcap 的诱导表达
• 1.5.1 IPTG 诱导剂诱导表达
• 1.5.2 SDS-PAGE 分析表达产物
• 1.6 蛋白的纯化
• 1.6.1 蛋白的大量制备
• 1.6.2 包涵体的制备与表达蛋白的可溶性鉴定
• 1.6.3 包涵体的洗涤
• 1.6.4 包涵体的溶解
• 1.6.5 包涵体的复性
• 1.6.6 包涵体的的纯化
• 1.7 纯化蛋白的分析
• 1.7.1 Western blotting 分析
• 1.7.2 蛋白浓度的测定
• 1.8 多克隆抗血清的制备
• 1.8.1 表达产物免疫前处理
• 1.8.2 免疫动物
• 1.8.3 阴阳性血清的制备
• 1.9 间接 ELISA 方法的建立
• 1.9.1 抗原包被浓度和阳性血清稀释度的最佳工作浓度的确定
• 1.9.2 羊抗鸭酶标二抗稀释度最佳工作浓度的的确定
• 1.9.3 抗原最佳包被时间的确定
• 1.9.4 ELISA 反应时间的确定
• 1.9.5 间接 ELISA 阴、阳性临界值的确定及结果判定
• 1.9.6 特异性分析和重复性试验
• 1.9.7 间接 ELISA 方法的初步应用
• 2 结果与分析
• 2.1 DuCV dcap 基因的克隆
• 2.1.1 DuCV dcap基因的扩增
• 2.1.2 重组质粒的构建与鉴定
• 2.2 目的基因的诱导表达
• 2.2.1 IPTG 浓度优化结果分析
• 2.2.2 诱导时间的优化
• 2.2.3 表达蛋白的可溶性分析
• 2.2.4 dcap 蛋白的纯化
• 2.3 纯化蛋白的分析
• 2.4 多克隆抗血清的制备
• 2.5 检测DuCV抗体间接ELISA方法的建立
• 2.5.1 抗原包被和阳性血清的最佳工作浓度的确定
• 2.5.2 羊抗鸭酶标二抗最佳稀释度的的确定
• 2.5.3 抗原最佳包被时间的确定
• 2.5.4 ELISA 反应时间的确定
• 2.5.5 间接 ELISA 阴、阳性临界值的确定及结果判定
• 2.5.6 特异性分析和重复性试验
• 2.5.7 间接 ELISA 方法的初步应用
• 3 讨论
• 3.1 重组表达载体的构建
• 3.2 包涵体的纯化
• 3.3 DuCV 的检测方法
• 3.4 临床检测结果分析
• 4 结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 作者简介及在读期间发表论文