螺内酯对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中骨形成蛋白-7的表达的影响

论文摘要

目的:肾间质纤维化是多种原因引起的细胞外基质成分在肾间质内过度沉积。肾间质纤维化是多种肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同通路。近年研究显示肾间质纤维化是导致慢性肾功能损伤的主要因素之一,肾间质纤维化的程度与肾功能的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切。阻止或延缓这一过程的发生与发展,可延缓慢性肾衰的发生。肾间质纤维化的机制较为复杂,多种细胞因子和生长因子均参与肾间质纤维化的发生和发展,其中研究最多、作用最明显的是转化生长因子β1（transforming growth factor, TGF-β1）。它是一种强效的致纤维化因子,在肾间质纤维化时表达增加,并成为目前抗纤维化治疗的主要靶标。骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein7, BMP-7）是转化生长因子超家族的另一成员,在肾脏疾病中表现正相反。国外有实验证明BMP-7对于防止肾小管间质纤维化,保护肾功能起有益的作用,并被认为是一种潜在的内源性肾脏保护因子,具有很好的应用前景,但国内对BMP-7在肾脏方面的研究还不是很完善。细胞外基质（extra cellular matrix, ECM）产生增加和（或）降解减少导致的ECM异常积聚,是肾间质纤维化重要机制之一。TGF-β1通过增加ECM成分如I、II、III、IV型胶原及纤维连接蛋白促使ECM沉积,因此,下调TGF-β1制其在肾间质纤维化发生、发展中的作用,是一种有效的防止纤维化的手段。在肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）中,血管紧张素II受体拮抗剂对肾脏的保护作用已得到人们的公认,但对醛固酮研究较少。近年研究证明,醛固酮作为独立的因素参与了心、肝、肺等器官组织的纤维化。醛固酮也是肾纤维化过程中一个重要因素,越来越受到各国学者的重视。新近国外文献报道,在单侧肾切除致高血压大鼠模型、残余肾衰竭模型、慢性环胞霉素A肾毒性的大鼠模型中发现,醛固酮能增加前炎症基因MCP-1、IL-6、IL-1β的表达,上调TGF-β1、刺激肾间质Ⅰ型胶原合成和纤维连接蛋白分泌,导致ECM堆积,醛固酮加速了肾间质纤维化的形成,加重蛋白尿和肾功能衰竭。这些实验研究同时应用醛固酮受体拮抗剂,其能减低上述炎症因子及TGF-β1的表达。减轻了ECM的沉积,明显减轻了肾小球及肾间质纤维化。然而,醛固酮受体拮抗剂应用于预防及减轻肾间质纤维化的报道在国内尚不多见。本实验以大鼠单侧输尿管结扎术（unilateral ureteral obstruct, UUO）建立肾间质纤维化模型,以醛固酮受体拮抗剂螺内酯灌胃法作用于该模型,通过观察肾脏病理改变,观察BMP-7在肾组织中的分布和表达,及其与肾小管间质损害之间的关系,免疫组织化学方法检测BMP-7蛋白表达变化,同时应用反转录PCR方法观察BMP-7 mRNA的表达情况,进一步证明BMP-7在肾间质纤维化中的作用,研究螺内酯在肾间质纤维化中对BMP-7的影响,本实验通过对肾间质纤维化机制的进一步揭示,为慢性肾脏病的临床治疗提供了理论指导。方法:选择健康雄性SD大鼠36只（清洁级）,体重180～200 g。随机分为假手术组（A组）、UUO组（B组）、UUO+螺内酯治疗组（C组）,每组各12只。每组又因于术后第7、14天分批处死而分为N7、N14组,每组各6只。10%水和氯醛（3 mg/kg体重）经腹腔注射麻醉后,行左侧输尿管结扎术,建立单侧输尿管梗阻模型,假手术组只游离输尿管但不结扎。C组给予螺内酯20 mg/Kg,溶于适量生理盐水中灌胃,A组和B组给予等量生理盐水灌胃,每日一次。分别于术后第7、14天处死。迅速切取左肾,去掉包膜,按冠状位纵形剖开,一部分立即置于Eppendorf管中液氮冷冻,随后于-70℃低温冰箱中保存以备提组织RNA,另一部分置于10%中型甲醛中固定后行石蜡包埋。左侧肾组织行HE染色,光镜观察肾脏病理改变。采用免疫组织化学染色测定肾间质BMP-7蛋白表达,结果应用图像分析系统进行分析。反转录PCR检测BMP-7 mRNA水平,结果应用凝胶成像系统分析成像。所有结果用均数±标准差（±s）表示,组间比较采用单因素方差分析,利用SPSS 10.0软件进行统计学分析。结果:HE染色肾脏组织学检查假手术组无明显病理改变。梗阻组随时间延长,梗阻侧肾脏间质纤维化逐渐形成并进展,而肾小球改变不明显。可见:1肾小管逐渐扩张,14天肾小管扩张同时伴肾小管结构破坏。2纤维化由轻到重,肾间质逐渐增宽,胶原成分逐渐增加。3炎症细胞浸润增加。4血管壁逐渐增厚,纤维化。5肾小球囊增厚,纤维化。6肾小球病变轻,常到轻度系膜增生。Masson染色上显示的病理改变同HE染色,而胶原纤维被染成兰色,细胞染成红色,随梗阻时间延长,可见胶原组织逐渐增多。免疫组化结果显示: BMP-7在假手术组中可见在肾小球、集合管和乳头管有中度的表达,手术组7天后表达逐渐下降,14天后进一步下降,但肾脏中仍有一定量表达,低于治疗组,主要在肾小球和管腔中。反转录PCR结果显示: BMP-7 mRNA表达,A组BMP-7 mRNA有基础表达;B组及C组BMP-7 mRNA表达下降（P<0.01）且随时间延长表达量逐渐减少（P<0.01）;C组第7天、14天的BMP-7 mRNA表达均显著高于同期B组（P<0.01）。结论: UUO大鼠中,随梗阻时间的延长,肾间质纤维化,大鼠肾间质炎症反应加重,BMP-7在梗阻侧肾组织中的表达逐渐减少,提示BMP-7可能是一种具有抑制纤维化的肾脏保护作用的因子。醛固酮受体拮抗剂螺内酯减轻肾间质炎性细胞浸润及肾间质纤维化程度,上调BMP-7蛋白及BMP-7 mRNA水平。醛固酮受体拮抗剂螺内酯可能通过上调BMP-7水平抑制及延缓单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的进展,起到肾脏保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 螺内酯对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织中骨形成蛋白-7 的表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 BMP-7 与肾间质纤维化
• 致谢
• 个人简历