传统中药中二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的筛选及体内药效学的初步研究

论文摘要

二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl peptidaseⅣ, DPP-Ⅳ; EC3.4.14.5/CD26）属于丝氨酸肽酶中脯氨酸寡肽酶家族成员之一,是目前糖尿病新药研发的热点之一。体内外研究显示胰高血糖素样肽-1（GLP-1）具有较好的抗糖尿病效应,但是由于其体内被以DPP-Ⅳ为主的酶降解,半衰期仅2 min,因而限制了其在临床上的应用。研究表明DPP-Ⅳ抑制剂能延长GLP-1在体内的半衰期,从而有效地降低血糖。目前已有多个化合物进入二期、三期临床实验,甚至上市销售。本文从中药入手筛选在体外体内对DPP-Ⅳ有抑制作用的药物,为今后获得具有抑制DPP-Ⅳ功能的新结构化学物打下基础。以Gly-Pro-PNA为反应底物,采用发色底物法检测DPP-Ⅳ的活性,建立DPP-Ⅳ抑制剂的体外筛选模型。实验对酶量、底物浓度、最佳温度、pH及反应时间进行了优化结果为:酶量为0.5 U/L、底物浓度为0.262μmol/L、温度37℃、pH 8.2时可获最大酶活性。在此基础上以抑二肽素A（IIe-Pro-IIe）为阳性药物,进一步证实了该模型的可行性。建立了具有323味中药的天然药用植物库。应用上述已建立模型对中药进行筛选,得到了在体外具有DPP-Ⅳ活性抑制作用的三种中药水蛭,茯神,密蒙花,三者的抑制作用均与药物浓度呈正相关,其中同浓度下密蒙花的抑制率最高。通过观察四氧嘧啶造模糖尿病小鼠的生理状态、血糖等方面考察了这三种中药的降糖作用,并进一步考察了水蛭、密蒙花两种中药对四氧嘧啶型糖尿病小鼠糖耐量及血清胰岛素和GLP-1水平的影响。结果表明水蛭,密蒙花在体内具有一定的降血糖作用,其作用途径可能是通过抑制DPP-Ⅳ活性起作用,而茯神在体内则无明显的降血糖作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 糖尿病及其治疗现状
• 1.1.1 糖尿病的研究概况
• 1.1.2 糖尿病的病因和发病机制
• 1.1.3 糖尿病治疗现状
• 1.1.4 糖尿病药物治疗的最新进展
• 1.2 二肽基肽酶Ⅳ及其抑制剂的简介
• 1.2.1 DPP-Ⅳ的分子结构
• 1.2.2 DPP-Ⅳ的催化特点
• 1.2.3 DPP-Ⅳ抑制剂的生理功能
• 1.3 DPP-Ⅳ抑制剂的研究现状
• 1.3.1 国外的研究动态及发展趋势
• 1.3.2 现有DPP-Ⅳ抑制剂的化学结构
• 1.4 以DPP-Ⅳ为靶点的药物筛选
• 1.4.1 药物筛选模型
• 1.4.2 药物筛选样品库
• 1.4.3 DPP-Ⅳ活性的检测方法
• 1.5 天然药物在治疗糖尿病方面的应用
• 1.6 本课题研究的主要内容
• 第二章 DPP-Ⅳ抑制剂体外筛选方法的建立
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 主要溶液
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 DPP-Ⅳ酶促反应体系的建立及酶活性的检测
• 2.3.2 酶浓度的确定
• 2.3.3 底物浓度的确定
• 2.3.4 温度的确定
• 2.3.5 pH 的确定
• 2.3.6 抑制剂对酶活的影响
• 2.3.7 精密度试验
• 2.3.8 统计学方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 微量DPP-Ⅳ反应体系的确立
• 2.4.2 酶浓度的确定
• 2.4.3 底物浓度的确定
• 2.4.4 最佳反应温度的确定
• 2.4.5 最佳pH 的确定
• 2.4.6 抑制剂对酶活的影响
• 2.4.7 精密度实验
• 2.5 本章小结
• 第三章 体外具有DPP-Ⅳ抑制作用的中药筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 主要试剂与材料
• 3.3 方法
• 3.3.1 中药样品库的建立
• 3.3.2 药物筛选
• 3.3.3 统计学方法
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 初筛结果
• 3.4.2 复筛结果
• 3.4.3 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 具有DPP-Ⅳ抑制作用中药的体内药效学研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 三种中药对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠体重、饮食、饮水以及血糖的影响
• 4.3.2 降糖中药对四氧嘧啶糖尿病小鼠糖耐量及血清胰岛素、GLP-1 的影响
• 4.3.3 统计学分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 药物对四氧嘧啶糖尿病小鼠体重变化的影响
• 4.4.2 药物对四氧嘧啶糖尿病小鼠采食量和饮水量变化的影响
• 4.4.3 药物对糖尿病小鼠空腹血糖的影响
• 4.4.4 药物对四氧嘧啶糖尿病小鼠糖耐量的影响
• 4.4.5 药物对四氧嘧啶糖尿病小鼠血清胰岛素的影响
• 4.4.6 药物对四氧嘧啶糖尿病小鼠血清GLP-1 的影响
• 4.4.7 讨论
• 4.5 本章小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文