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大豆GmNF-YC1，2，3基因的克隆与功能分析

2020-12-10阅读(801)

大豆GmNF-YC1，2，3基因的克隆与功能分析

论文摘要

在植物中，NF-Y（Nuclear Factor Y）家族转录因子参与调节多种生理生化过程，诸如胚胎发育、蓝光信号转导、干旱胁迫、光周期开花、内质网应激反应、ABA（abscisic acid）的传输、固氮根瘤的发育、光合作用和根的延伸等等。但是，对大豆的NF-YC家族基因的研究，尚属空白。本研究根据拟南芥NF-YC基因家族蛋白序列和大豆基因蛋白序列比对分析，预测到了15个大豆GmNF-YCs基因，他们分属于9条染色体上。根据已发表的大豆基因组序列，我们从大豆“垦农18”的cDNA中克隆到了3个NF-YC基因，分别命名为GmNF-YC1，2，3。生物信息学分析表明：它含有DNA结合域、与NF-YA和NF-YB的相互作用区域以及CCAAT结合域，这些功能域与拟南芥等植物中的同源基因NF-YC3，4，9高度保守，表明GmNF-YC1，2，3基因可能具有与拟南芥的AtNF-YC3，4，9的类似功能相似，可能参与光周期开花调控。利用实时定量PCR（quantitative real time RT-PCR, qPCR）对它们时空表达进行了监测。结果显示，GmNF-YC2在长日照和短日照下均表现出明显的节律性，GmNF-YC3在长日照下表现出一定的节律性，而GmNF-YC1转录水平表达不受光周期及生物钟的调控。生长发育时期及不同组织器官中，GmNF-YC1，2，3具有类似的时空表达模式，并都在特定的组织有较高表达，其表达主要集中在叶片中并且最高表达量出现在开花期。在拟南芥原生质体瞬时表达体系中证实，GmNF-YC1，2蛋白可能定位于细胞核内，GmNF-YC3在细胞核和细胞质中可能均有分布。酵母双杂交实验证GmNF-YC1/GmNF-YC2/GmNF-YC3和GmCOL3/GmCOL4/GmCOL5有部分相互作用现象。本文结果为进一步研究大豆NF-YC家族基因的功能和大豆分子育种提供了重要的依据。

论文目录

  • 致谢
  • 目录
  • 摘要
  • 1 文献综述
  • 1.1 大豆的形态与价值的介绍
  • 1.2 植物的开花调控途径
  • 1.2.1 光周期途径
  • 1.2.2 光受体
  • 1.2.3 生物钟的核心反馈调控环
  • 1.2.4 光周期途径中调控 CO 的机理
  • 1.2.5 光周期途径中 CO/FT 调控机制
  • 1.3 NF-Y 家族在植物中的作用
  • 2 引言
  • 3 材料与方法
  • 3,1 实验材料
  • 3.1.1 植物材料
  • 3.1.2 菌株及载体
  • 3.2 常用药品
  • 3.3 主要仪器
  • 3.4 实验引物
  • 3.5 常用试剂及培养基配制
  • 3.5.1 常用试剂及培养基
  • 3.5.2 拟南芥原生质体制备及转化的试剂
  • 3.5.3 酵母双杂所需试剂及培养基
  • 3.6 实验方法
  • 3.6.1 候选基因的选定与引物设计
  • 3.6.2 系统进化树构建
  • 3.6.3 基因功能结构域预测
  • 3.6.4 DNA 提取
  • 3.6.5 RNA 提取与纯化
  • 3.6.5.1 实验前准备
  • 3.6.5.2 RNA 提取
  • 3.6.5.3 RNA 纯化
  • 3.6.5.4 RNA 反转录
  • 3.6.6 目的基因的克隆
  • 3.6.7 基因表达载体的构建
  • 3.6.8 大肠杆菌感受态的制备和宿主转化
  • 3.6.8.1 大肠感受态细胞制备
  • 3.6.8.2 质粒提取
  • 3.6.8.3 质粒转化大肠杆菌
  • 3.6.9 农杆菌感受态的制备和宿主转化
  • 3.6.9.1 农杆菌感受态的制备
  • 3.6.9.2 农杆菌感受态转化
  • 3.7
  • 3.7.1 拟南芥原生质体转化
  • 3.7.1.1 原生质体制备
  • 3.7.1.2 原生质体转化
  • 3.7.2 酵母双杂交
  • 3.7.2.1 酵母感受态细胞制备
  • 3.7.2.2 酵母感受态转化
  • 3.7.2.3 阳性克隆筛选
  • 3.7.2.4 酵母 X-gal 染色实验
  • 3.7.3 拟南芥转化及筛选
  • 3.7.3.1 拟南芥蘸花转化
  • 3.7.3.2 转基因植株的筛选及开花表型分析
  • 4 结果与分析
  • 4.1 GMNF-YC1,2,3 基因的克隆分析
  • 4.2 GMNF-YC1，2，3 的进化分析
  • 4.3 大豆部分 GMNF-YCS MRNA 表达水平分析
  • 4.3.1 GmNF-YCS 特异性表达分析
  • 4.3.1.1 GmNF-YC1 特异性表达分析
  • 4.3.1.2 GMNF-YC1 的光周期昼夜节律性表达分析
  • 4.3.1.3 GmNF-YC2 组织特异性表达分析
  • 4.3.1.4 GmNF-YC2 mRNA 的光周期昼夜节律性表达分析
  • 4.3.1.5 GmNF-YC3 的组织特异性表达分析
  • 4.3.1.6 GmNF-YC3 的 mRNA 的光周期昼夜节律性表达分析
  • 4.4 GMNF-YC1,2,3 蛋白亚细胞定位
  • 4.5 GMNF-YC1/ GMNF-YC2/GMNF-YC3 与 GMCOL3/GMCOL4/GMCOL5 酵母双杂交实验
  • 5 结论与讨论
  • 5.1 讨论
  • 5.2 结论
  • 参考文献
  • 英文摘要

    • 相关论文文献

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