里氏木霉的紫外诱变和高活性纤维素酶突变株的选育

论文摘要

以纤维素、半纤维素和木质素形式存在的生物质原料数量丰富,发展和利用生物质能源是实现经济、社会可持续发展的有效途径。在生物质原料转化利用方面,里氏木霉（Trichoderma reesei）是产纤维素酶的重要菌种之一,其生产的纤维素酶在能源、生物防治、食品等多个领域都得到了广泛的应用。本研究通过对里氏木霉进行紫外诱变,以筛选出高产纤维素酶的突变菌株,进一步提高其纤维素酶的产量,降低生产成本为目的。本文基于筛选高产纤维素酶突变菌株的目的,对里氏木霉Rut C30进行紫外诱变,筛选突变菌株,并对其突变菌株的产酶条件进行优化,通过随机扩增多态性DNA （RAPD）对出发菌株和突变菌株的基因组进行分析。对T.reesei Rut C30的孢子悬液进行紫外线诱变,确定最佳诱变时间为40s,该剂量下致死率为83.500%,正突变率为8.679%,以刚果红筛选培养基上水解圈与菌落直径的比值（H/d）为指标,进行初筛,再以液体发酵产酶进行复筛,最终获得了一株突变株A13,其滤纸酶活为4.328U/ml,相较于出发菌株2.786U/ml的酶活,提高了55.350%。对突变株A13进行6代连续培养,酶活稳定在4.160U/ml,其遗传稳定性较好。通过碳源、复合氮源、产酶温度这三个单因素优化实验,获得了突变菌株A13产酶的最佳条件,以1.000%微晶纤维素为碳源、0.150%蛋白胨与0.050%硫酸铵为复合氮源,产酶温度为28℃的条件下,突变菌株A13的滤纸酶活为4.915U/ml,比优化前的4.160U/ml提高了18.150%。在含有微晶纤维素的产酶培养基中添加适量的麦芽浸粉,实验表明,麦芽浸粉确实能促进里氏木霉的突变株产出更多的纤维素酶。当在1.000%微晶纤维素的基础上添加1.000%麦芽浸粉时,滤纸酶活提高到了5.720U/ml。采用中心复合实验设计,寻找微晶纤维素与麦芽浸粉的最佳配比。对中心复合实验设计的实验结果进行响应面分析,结果表明,在优化后的产酶条件下,当微晶纤维素和麦芽浸粉分别为13.19g/L和11.03g/L时,实际测定的滤纸酶活可以达到5.986U/ml,接近软件预测的最大值6.082U/ml。对出发菌株及4株突变菌株的基因组DNA进行RAPD分析,并对RAPD-PCR的反应体系进行优化。筛选出6个随机引物后,对它们的扩增条带进行聚类分析,结果显示这5株菌的遗传相似系数在0.6046512-0.8837209之间,表明它们之间有较近的亲缘关系,但存在一定的遗传变异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 生物质能源
• 1.1.2 利用生物质的微生物
• 1.2 木霉属及其纤维素酶
• 1.2.1 木霉属的发展史
• 1.2.2 木霉菌的形态特征
• 1.2.3 里氏木霉
• 1.2.4 纤维素酶
• 1.2.5 纤维素酶的作用机制
• 1.3 木霉属及其酶的应用
• 1.3.1 在生物防治上的应用
• 1.3.2 在工业上的应用
• 1.4 诱变机理
• 1.4.1 物理诱变剂
• 1.4.2 化学诱变剂
• 1.5 里氏木霉的高产诱变突变株选育
• 1.5.1 T.reesei RUT C30
• 1.5.2 T.reesei RL P37
• 1.5.3 其他突变株
• 1.6 突变机制
• 1.6.1 基因组的特点
• 1.6.2 高产突变株的基因变异
• 1.7 本研究的意义和主要内容
• 1.7.1 本研究的意义
• 1.7.2 本研究的主要内容
• 第二章 紫外诱变里氏木霉
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 孢子悬液的制备
• 2.2.2 诱变剂量的选择
• 2.2.3 紫外诱变
• 2.2.4 突变株的初筛
• 2.2.5 突变株的复筛
• 2.2.6 突变株的产酶培养
• 2.2.7 分析方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 诱变剂量的选择
• 2.3.2 诱变后初筛菌落形态
• 2.3.3 突变株的初筛
• 2.3.4 突变株的复筛
• 2.3.5 突变株的遗传稳定性
• 2.4 小结
• 第三章 突变株液体发酵产酶培养基的优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 单因素实验
• 3.2.2 摇瓶产酶实验
• 3.2.3 中心复合实验设计优化培养基
• 3.2.4 分析方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 碳源对产酶活力的影响
• 3.3.2 复合氮源对产酶活力的影响
• 3.3.3 产酶温度对产酶活力的影响
• 3.3.4 产酶培养基优化
• 3.4 小结
• 第四章 里氏木霉及其突变株的RAPD分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 DNA提取用主要试剂
• 4.1.4 RAPD及PCR试剂
• 4.1.5 电泳及其检测用试剂
• 4.1.6 RAPD引物
• 4.1.7 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 Rut C30及其突变株的培养
• 4.2.2 Rut C30及其突变株基因组DNA的提取
• 4.2.3 PCR扩增反应
• 4.2.4 RAPD体系的优化
• 4.2.5 RAPD引物的筛选检测
• 4.2.6 出发菌株与突变菌株的比较分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Rut C30及其突变株的基因组DNA
• 4.3.2 DNA模板浓度对PARD扩增的影响
• 2+浓度对PARD扩增的影响'>4.3.3 Mg²⁺浓度对PARD扩增的影响
• 4.3.4 dNTPs浓度对PARD扩增的影响
• 4.3.5 引物浓度对PARD扩增的影响
• 4.3.6 Taq聚合酶浓度对PARD扩增的影响
• 4.3.7 优化后的RAPD-PCR反应体系
• 4.3.8 RAPD结果分析
• 4.4 小结
• 第五章 结论和创新
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 不足
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 附录A 缩略词表
• 附录B DNA Marker
• 附录C 攻读硕士学位期间的主要学术成果
• 致谢