广西HIV-1重组流行株基因变异的研究和快速基因分型方法的建立

论文摘要

目的:（1）研究广西 HIV-1 重组流行株亚型 env 基因 V3-V4 区及其临近区域的基因变异和其与生物表型之间的关系。（2）建立一种快速基因分型方法,对广西 HIV-1 重组流行株进行亚型鉴定。方法:（1）应用 nest-PCR 对 50 份来自广西主要流行区的 HIV-1 毒株 env 和 gag 基因区进行扩增后,使用 ABI 310型测序仪测序,然后应用 CLUSTAL、MEGA 和 dnatools 等生物学软件对 env基因区 V3-V4 区及其临近区域进行系统树和氨基酸分析。（2）从 50 份 HIV阳性样品中提取核酸,使用 HIV-1 M 组通用引物对 env 和 gag 基因区进行第一轮扩增,第二轮使用分别检测 C、CRF01-AE 亚型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增,根据不同亚型扩增的目的条带位置不同来判断亚型;另外对 gag 基因区设计了一套引物,专用于检测 B′/C;同时使用通用的内侧引物进行扩增,以验证特异性引物是否正确,扩增出的所有样品均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果:（1）从 50 份毒株中获得 46 份基因序列,3 份为 CRF08-BC（6.52%）,43 份为 CRF01-AE（93.48%）;系统树分析显示,3 份 CRF08-BC 中 2 份与 CRF08-BC.98CN006 和 CRF08-BC.97CNGX6f靠近,还有 1 份样品则接近 C.95IN21068;43 份 CRF01-AE 重组毒株中 41 份与分离于广西地区的 CRF01-AE.97CNGX2f 和泰国代表毒株 THCM240 接近,另外 2 份与 90CF402 聚成一簇;24 份毒株 env V3-V4 区核苷酸序列分析显示,广西的样本与分离于该地区的代表毒株基因距离较小,CRF08-BC 和CRF01-AE 重组毒株的氨基酸替换主要发生在 C3 和 V4 区,而 V3 区氨基酸序列相对保守;46 份毒株 V3 区及临近基因区氨基酸序列分析显示,CRF08-BC毒株 V3 顶端四肽为 GPGQ,而 CRF01-AE 毒株则存在着 7 种类型:GPGQ

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 广西 HIV-1 重组流行株env 基因 V3-V4 区序列变异分析
• 一、实验材料
• 1. 主要仪器和设备
• 2. 主要试剂
• 3. 主要试剂配制
• 4. 主要生物软件和分析工具
• 5. 样本来源
• 二、实验方法
• 1.D NA 提取
• 2.H IV-1 基因区扩增
• 3.P CR 扩增产物鉴定
• 4. 扩增产物的回收与纯化
• 5.P CR 产物的测序
• 6. 序列分析
• 7. 统计分析
• 8. 质量控制
• 三、实验结果
• 1.P CR 扩增和序列鉴定
• 2. 基因序列分析结果
• 四、讨论
• 1. 广西 HIV-1 重组毒株系统树分析
• 2. 广西重组毒株基因序列变异及其与生物表型和辅助受体预测的分析
• 第二部分 广西 HIV-1 重组流行株快速基因分型方法的建立
• 一、材料和方法
• 1. 主要仪器和设备、试剂、DNA 的提取方法
• 2. 样品来源
• 3.H IV-1 亚型特异性引物的设计
• 4.H IV-1env、gag 区基因扩增
• 5. 扩增片断的检测
• 6. 基因测序和系统进化树分析
• 7. 重复性实验
• 二、实验结果
• 1. 样品基因测序和序列分析结
• 2. 亚型特异性引物检出结果分析
• 3. 特异性引物检测其它亚型样品的结果
• 4. 特异性引物 PCR 法的重复性
• 5. 基因测序法与特异性引物 PCR 法比较
• 三、讨论
• 1. 亚型特征性位点分析
• 2. 结果分析
• 小结
• 参考文献
• 综述 HIV 基因变异及基因分型方法的研究进展
• 附录 研究生期间发表的文章
• 致谢