漆酶高产菌株的诱变选育及其酶的分离纯化、性质和基因克隆研究

论文摘要

漆酶（EC1．10．3．2）是一种含铜的多酚氧化酶，广泛分布于真菌特别是白腐菌中，在高等植物、细菌、昆虫体内也有不同程度的存在。漆酶可与多酚类和芳香二胺类等多种底物作用，在木质素降解、制浆造纸生物漂白、环境保护、生物传感器制作、有机合成、食品及饮料加工等领域具有广阔的应用前景和潜在应用价值。本文以木质素降解白腐真菌粗毛拴菌（Trametes gallica）为出发菌，采用紫外诱变选育漆酶高产菌株，并对菌株产酶条件、酶的分离纯化、酶学性质和基因克隆进行了系统研究。取得如下主要研究结果： 1．以粗毛栓菌T．gallica为出发菌株，通过紫外诱变处理其担孢子、PDA-RB亮蓝平板变色法初筛、ABTS法测定培养液漆酶活力复筛，获得1株漆酶高产诱变菌株SAH-12。用高氮低碳高无机盐培养液（LM3）培养时，其峰值酶活力比出发菌株高出4倍，达到5002.6U／L，且产酶稳定。对SAH-12液体培养产酶条件研究表明：以纤维二糖和蔗糖为碳源明显优于麦麸、淀粉和葡萄糖，其最高酶活分别达18526U／L和13436U／L；有机氮源较无机氮源更有利于SAH-12漆酶的分泌，以蛋白胨、大豆粕和胰化蛋白胨为氮源时其峰值酶活分别达到20544U／L、19671U／L和16180U／L；适宜初始培养pH为4.0；ABTS、单宁酸、没食子酸对产酶均有明显的诱导作用，其中ABTS和单宁酸的诱导效果相对更好，愈创木酚和吐温-80对产酶有一定的抑制作用；SAH-12在优化的培养液中，漆酶最高活性产量可达26373.5U／L。 2．应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）活性染色和RAPD（RandomAmplified Polymorphic DNA）技术，对T．gallica及其紫外诱变选育菌株SAH-12进行了漆酶同工酶谱和基因组DNA的RAPD比较分析。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳活性

论文目录

第一章漆酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 主要仪器及试剂

2.1.3 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的活化与保存

2.2.2 孢子悬浮液的制备

2.2.3 紫外诱变

2.2.4 有益突变菌株的初筛

2.2.5 有益突变菌株的复筛

2.2.6 漆酶活性测定

2.2.7 遗传稳定性筛选

3 结果与分析

3.1 孢子悬浮液的制备与紫外诱变剂量的确定

3.2 有益突变菌的获得及其产酶特性

3.3 碳源对SAH-12漆酶分泌的影响

3.4 氮源对SAH-12漆酶分泌的影响

3.5 培养基初始pH对SAH-12漆酶分泌的影响

3.6 诱导剂对SAH-12漆酶分泌的影响

3.7 综合因素对SAH-12漆酶分泌的影响

4 讨论

4.1 紫外诱变与高产菌株筛选

4.2 菌株产酶条件的优化

5 参考文献

第二章粗毛栓菌及其诱变菌株SAH-12漆酶同工酶和RAPD比较分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 主要仪器及试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 溶液和缓冲液

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的活化与保存

2.2.2 粗酶液的制备

2.2.3 同工酶电泳分析

2.2.4 基因组DNA的提取与检测

2.2.5 RAPD分析

3 结果与分析

3.1 碳源对漆酶同工酶分泌的影响

3.2 氮源对漆酶同工酶分泌的影响

3.3 初始培养pH对漆酶同工酶分泌的影响

3.4 诱导剂对漆酶同工酶分泌的影响

3.5 SAH-12和T.gallica基因组DNA的RAPD分析结果

4 讨论

4.1 培养条件对SAH-12和T.gallica漆酶同工酶谱的影响

4.2 SAH-12和T.gallica同工酶谱与酶活性产量的关系

4.3 SAH-12和T.gallica基因组DNA的多态性

5 参考文献

第三章粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶的分离纯化与酶学性质研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 主要仪器及试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 溶液和缓冲液

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的活化与保存

2.2.2 粗酶液的制备

2.2.3 同工酶电泳分析

2.2.4 漆酶活性测定

2.2.5 蛋白质含量测定

2.2.6 漆酶的分离纯化

2.2.7 表观分子量测定

2.2.8 等电点测定

2.2.9 糖含量测定

2.2.10 动力学常数Km值的测定

2.2.11 温度对酶活性和热稳定性的影响

2.2.12 pH对酶活性和稳定性的影响

2.2.13 金属离子和抑制剂对酶活性的影响

2.2.14 对苹果汁多酚去除率的测定

2.2.15 对不同染料的脱色率测定

3 结果与分析

3.1 漆酶同工酶

3.2 漆酶的分离纯化

3.2.1 硫酸铵分级盐析饱和度的确定

3.2.2 漆酶的分离纯化

3.3 漆酶Lac1的酶学性质

3.3.1 表观分子量、等电点和糖含量

3.3.2 动力学常数Km值

3.3.3 最适反应温度及热稳定性

3.3.4 最适反应pH及pH稳定性

3.3.5 金属离子和抑制剂对酶活性的影响

3.3.6 对苹果汁多酚的去除作用

3.3.7 对染料的脱色作用

4 讨论

4.1 SAH-12漆酶Lac1与出发菌T.gallica漆酶的性质比较

4.2 SAH-12漆酶Lac1的应用潜力

4.3 值得进一步探讨的问题

5 参考文献

第四章粗毛栓菌及其诱变株SAH-12在麦草培养基中产漆酶和降解木质纤维素研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 主要仪器及试剂

2.1.3 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 菌株的培养

2.2.2 漆酶的提取

2.2.3 漆酶活性测定

2.2.4 培养基干失重率测定

2.2.5 纤维素含量测定

2.2.6 半纤维素含量测定

2.2.7 木质素含量测定

3 结果与分析

3.1 SAH-12和T.gallica在麦草粉培养基中产漆酶的能力

3.2 SAH-12和T.gallica对麦草粉的降解能力

4 讨论

4.1 SAH-12和T.gallica漆酶产量与木质纤维素降解的关系

4.2 天然麦草粉对T.gallica和SAH-12漆酶分泌的影响

4.3 影响T.gallica和SAH-12降解天然麦草粉木质纤维素的因素

4.4 T.gallica和SAH-12固体发酵降解天然麦草粉木质纤维素的特征

5 参考文献

第五章粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 菌株及载体

2.1.3 培养基

2.2 实验方法

2.2.1 总RNA的提取和检测

2.2.2 基因组DNA的提取和检测

2.2.3 漆酶基因克隆引物的设计

2.2.4 漆酶基因3′-末端cDNA的合成

2.2.5 漆酶基因5′-末端cDNA的合成

2.2.6 漆酶结构基因和cDNA的合成

2.2.7 PCR产物的回收与纯化

2.2.8 质粒DNA的小量制备

2.2.9 大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA转化

2.2.10 重组子的筛选和鉴定

2.2.11 DNA序列测定与分析

3 结果与分析

3.1 基因组DNA的制备

3.2 总RNA的制备

3.3 漆酶基因3′-和5′-末端cDNA的克隆测序及全长cDNA序列的拼接

3.4 漆酶基因cDNA的克隆测序及推导氨基酸序列分析

3.5 漆酶结构基因的克隆测序及序列分析

3.6 SAH-12漆酶基因Lacc1编码成熟蛋白二级结构预测分析

3.7 SAH-12漆酶基因Lacc1编码成熟蛋白三级结构预测分析

4 讨论

4.1 SAH-12基因Lacc1编码漆酶的活性

4.2 SAH-12漆酶基因的拷贝数

4.3 SAH-12漆酶的N-糖基化位点及其结构基因的内含子

4.4 SAH-12漆酶基因Lacc1与T.gallica漆酶基因lacA的比较

5 参考文献

第六章漆酶的研究进展（文献综述）

1 引言

2 漆酶的分布

2.1 漆酶在真菌中的分布

2.2 漆酶在植物中的分布

2.3 漆酶在原核生物中的分布

2.4 漆酶在其它生物中的分布

3 漆酶产生真菌的选育

4 真菌漆酶的合成

4.1 漆酶的合成方式

4.2 影响漆酶合成的因素

5 漆酶的分离纯化

6 真菌漆酶的组成与理化特性

6.1 漆酶的分子量

6.2 漆酶的铜原子

6.3 漆酶的氨基酸序列

6.4 漆酶的多糖含量

6.5 漆酶的等电点pI

6.6 漆酶的最适反应温度

6.7 漆酶的最适反应pH

6.8 金属离子和酶抑制剂对漆酶反应活性的影响

6.9 反应介质对漆酶反应活性的影响

6.10 漆酶的底物特异性

7 漆酶的三维结构与活性中心

7.1 漆酶的三级结构

7.2 T1Cu单核结合位点

7.3 T2／T3Cu三核铜结合位点

8 漆酶的催化机理

8.1 漆酶的催化机理

8.2 漆酶的结构与氧化还原电位的关系

9 漆酶的生理功能

9.1 降解木质素及降解产物解毒

9.2 参与病源菌的致病过程

9.3 参与生物色素合成和昆虫表皮骨化

10 漆酶基因的克隆与表达

10.1 基因克隆

10.2 基因表达

11 漆酶的应用

11.1 生物制浆造纸

11.1.1 生物制浆

11.1.2 生物漂白

11.1.2 造纸废水处理

11.2 环境保护与修复

11.2.1 含氯芳香污染物和致癌多环芳香族化合物的降解

11.2.2 合成染料脱色与解毒

11.2.3 其它环境污染物的降解

11.3 生物传感器与生物检测

11.4 食品加工

11.5 有机合成

11.6 其它应用

12 参考文献

结论

致谢

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在读期间所做的工作

漆酶高产菌株的诱变选育及其酶的分离纯化、性质和基因克隆研究

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