克雷伯氏肺炎杆菌乳酸脱氢酶基因缺失突变株的构建及其应用

论文摘要

1,3-丙二醇（1,3-Propanediol,PDO）作为一种重要的化工原料,在聚酯、化妆品、食品、润滑以及医药等领域具有广泛用途,特别是作为生产聚酯PTT的单体而受到人们的关注。发酵法生产1,3-丙二醇因其环境友好、条件温和等优点逐渐成为近年的研究热点。对克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumonia）利用甘油流加补料生产1,3-丙二醇的研究表明,在发酵的同时会产生大量乳酸、乙酸等副产物。乳酸的大量产生是造成PDO产量和甘油转化率低以及后提取困难的主要原因。切断克雷伯氏肺炎杆菌的乳酸产生途径有望提高PDO产量和甘油转化率,并简化后提取工艺。利用PCR技术,以肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）AC02基因组DNA为模板,参考NCBI报道的K. pneumoniae MGH78578相关基因序列设计引物,扩增出约780bp编码乳酸脱氢酶基因ldh的序列。将自杀质粒pGP704-AP的氨苄抗性基因Ap用从pMCm质粒上切下来的氯霉素抗性基因片段Cm替换,构建适用于肺炎克雷伯氏菌的自杀质粒pGP704-Cm.将乳酸脱氢酶基因ldh与自杀质粒pGP704-Cm连接,构建用于同源重组的自杀质粒pGP704-Cm-ldh。通过电击转化和双亲结合的方法,将重组自杀质粒pGP704-Cm-ldh导入肺炎克雷伯氏菌,根据同源重组原理,pGP704-Cm-ldh整合到克雷伯氏菌染色体上,得到遗传稳定的插入缺失突变株。本研究通过同源重组的手段构建得到了一株产乳酸途径中ldh基因插入缺失突变株,突变株的乳酸脱氢酶活性比亲本株大幅度降低。将突变株应用于1,3-丙二醇发酵,在微氧条件下,所能达到的1,3-丙二醇、2,3-丁二醇浓度、甘油的转化率较野生型菌株依次提高了15%、88%和32%;且乳酸产量比亲株低98%。此外,发酵过程中耗碱减少21%,后提取工艺得以简化,能耗降低。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1. 1，3-丙二醇的物理、化学性质
• 2. 1，3-丙二醇（PDO） 的主要用途
• 3. PDO的生产方法
• 3.1 化学合成法
• 3.2 微生物发酵法
• 二、克雷伯氏肺炎杆菌1,3-丙二醇代谢途径研究与改造
• 1 肺炎克克雷伯氏菌代谢
• 2 1,3-丙二醇基因工程菌的构建
• 2.1 过量表达还原途径中的限速酶编码基因
• 2.2 敲除氧化途径中无益副产物编码基因
• 2.3 构建辅酶再生系统
• 2.4 在甘油产生菌中构建合成1,3-丙二醇的基因工程菌
• 2.5 在E. coli 构建利用葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌
• 三、本论文的立题依据和研究内容
• 参考文献
• 第二部分 实验内容
• 第一章 实验材料与方法
• 1.1 主要的仪器设备和试剂
• 1.1.1 实验仪器
• 1.1.2 酶及试剂
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 培养基
• 1.3.1 E. coli 用培养基
• 1.3.2 Klebsiella 用培养基
• 1.4 发酵条件
• 1.5 分析方法
• 1.5.1 高效液相色谱分析方法
• 1.5.2 3-羟基丙醛分析方法
• 1.5.3 生物量的测定
• 1.5.4 D 型/L 型乳酸含量的测定
• 1.6 菌体胞内酶活性的测定方法
• 1.6.1 细胞提取物的准备方法
• 1.6.2 1,3-丙二醇氧化还原酶活性测定方法
• 1.6.3 甘油脱氢酶活性测定方法
• 1.6.4 甘油脱水酶活性测定方法
• 1.6.5 蛋白质的测定
• 1.7 DNA 操作方法
• 1.7.1 细菌基因组DNA 的提取方法
• 1.7.2 质粒DNA 的提取方法
• 1.7.3 PCR 产物的回收方法
• 1.7.4 电转化感受态细胞的制备
• 1.7.5 热冲击法转化感受态细胞
• 1.7.6 电转化
• 1.7.7 Klebsiella 两亲本接合
• 第二章 ldh基因的克隆及ldh缺失突变株的构建
• 2.1 自杀质粒pGP704-AP 的改造及重组自杀质粒pGP704-Cm-ldh 的构建
• 2.2 Klebsiella. pneumoniae AC02 的ldh 基因克隆与分析
• 2.3 质粒pGP704-Cm 的构建
• 2.4 基因敲除及乳酸缺失突变株的筛选
• 第三章 Klebsiella pneumonia AC02 重组菌株的发酵特性
• 3.1 发酵过程中关键酶酶活性变化
• 3.1.1 乳酸脱氢酶酶活性
• 3.1.2 1,3-丙二醇和2,3-丁二醇氧化还原酶酶活性
• 3.1.3 甘油脱水酶和甘油脱氢酶酶活性
• 3.2 突变株和野生型菌株流加补料发酵结果比较
• 3.2.1 微氧条件下克雷伯氏肺炎杆菌野生株5 升发酵罐发酵结果
• 3.2.2 微氧条件下LDH-突变株5 升发酵罐发酵结果
• 3.2.3 微氧条件下突变株LDH 与野生株发酵结果比较
• 3.2.4 微氧条件下突变株LDH 与野生型菌株甘油转化率的比较
• 3.2.5 生物柴油副产物甘油发酵产1,3-丙二醇
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表的论文和参加课题
• 致谢