豆梨遗传转化体系的建立及转基因植株增殖生根研究

论文摘要

豆梨是南方梨树常用砧木,耐瘠薄,对土壤的适应性强,抗旱,耐涝,抗腐烂病,跟西洋梨和中国梨的亲和性都很好,但不耐寒,苗期根系稀少,生长较弱。rolB基因是从Agrobacteciumrhizogenes菌的Ri质粒的T-DNA上分离出来的,rolB基因能够使植株矮化和明显的改善生根。将rolB基因转入砧木植株中,可使砧木矮化,增强生根能力。本研究以南方梨砧木豆梨的子叶作为转基因的受体材料,以rolB基因为外源基因,研究了不同预培养时间、工程菌液浓度、侵染时间、共培养时间以及筛选方法对其遗传转化效率的影响及适合转基因豆梨的增殖与生根培养基。以MS+NAA0.2mg/L+6-BA4mg/L为分化培养基,在此基础上进行了豆梨的遗传转化研究,通过豆梨子叶的敏感性试验,最终确定子叶诱导愈伤组织和不定芽时Kan的临界浓度为50mg/L,芽诱导生根时Kan的临界浓度为25mg/L,抑菌抗生素Cef和Carb保持在250mg/L时既能起到抑菌作用,又能保证有一定再生率。成功摸索出农杆菌介导的豆梨遗传转化体系：将豆梨子叶预培养4d,菌液浓度OD600=0.4,添加100μM/L的AS,侵染10min,共培养3d,预培养和共培养都在暗处25℃进行,共培养后依次加入25mg/LKan到50mg/LKan的量筛选或共培养后晚6d再加入50mg/LKan的量进行筛选。通过农杆菌介导法将外源rolB基因导入到豆梨中,为豆梨的遗传转化及抗性育种提供理论基础。其中一部分抗性苗在添加Kan的筛选培养基上的再生,并通过PCR分子检测,有4株出现了特异性扩增条带,而阴性对照没有特异性条带产生,说明外源基因已经初步整合到豆梨基因组中。豆梨子叶的遗传转化中最高不定芽分化率达到15%。通过对豆梨转化苗的增殖试验,表明转化苗继代增殖时以MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L+Kan25mg/L+Carb 180mg/L+Cef180mg/L为培养基。通过对转化苗豆梨的生根试验,表明转化植株在生根能力上明显强于对照,在以1/4MS+IBA3.0mg/L为生根培养基时,生根率为80%,而对照只有60%,转化植株表现为须根增多。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 农杆菌介导的梨转基因研究进展
• 1.1 农杆菌介导法的研究进展
• 1.2 农杆菌介导法在果树中的应用
• 1.3 农杆菌介导法在梨中的应用
• 1.4 梨转化中存在的问题
• 2 rol基因性状研究
• 2.1 rolB基因对生根影响研究
• 2.2 rol基因矮化性状研究
• 3 国内外梨矮化砧木的研究现状
• 4 本试验的目的
• 5 主要技术路线
• 第二章 豆梨农杆菌遗传转化体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 根癌农杆菌菌株及质粒
• 1.2 植物材料
• 1.3 遗传转化基本培养基
• 1.4 植物生长物质
• 1.5 细菌培养基
• 1.6 抗生素
• 1.7 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 子叶对Kan的敏感性分析
• 2.2 子叶对Cef和Carb的敏感性分析
• 2.3 Kan对植株生根的影响
• 2.4 Cef和Carb对植株生根的影响
• 2.5 农杆菌介导的rolB基因转化
• 2.5.1 预培养时间对转化的影响
• 2.5.2 As的浓度对转化的影响
• 2.5.3 菌液的浓度对转化的影响
• 2.5.4 侵染时间对转化的影响
• 2.5.5 共培养时间对子叶分化和转化的影响
• 2.5.6 筛选方式对转化的影响
• 2.6 抗性植株的获得
• 2.7 抗性植株的叶片再生
• 3 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.1.1 影响豆梨农杆菌转化效率的因素
• 3.1.2 豆梨转化植株的筛选
• 3.2 小结
• 第三章 转rolB基因豆梨分子检测及芽增殖生根研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 基因组DNA提取方法
• 1.2.2 基因组DNA提取步骤
• 1.2.3 PCR分子检测
• 1.2.4 增殖生根培养基
• 1.2.5 增殖生根培养方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR的检测结果
• 2.2 芽的增殖
• 2.2.1 植物生长调节剂对芽增殖的影响
• 2.2.2 转基因与对照芽增殖的差别
• 2.3 生根培养
• 2.3.1 不同培养基配方对豆梨生根的影响
• 2.3.2 转基因豆梨与对照生根差异
• 3 讨论与小结
• 3.1 讨论
• 3.2 小结
• 全文总结及下步工作设想
• 缩略词表
• 图版及说明
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历