论文摘要
第一部分γ-H2AX:体内精确分析DNA双链断裂及修复的指标目的:DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤形式,DSB修复缺陷会导致放射敏感性的显著增加。临床剂量放射治疗后,不同的组织显示出不同的放射反应,可能与其内在的放射敏感性相关,而关于体内各组织DSB修复的差异研究少见。电离辐射后,组蛋白H2AX在DSB处迅速磷酸化形成γ-H2AX焦点,已经证实γ-H2AX焦点可以作为体外分析DSB形成和修复的指标,在本研究中,我们观察不同放射敏感性小鼠系照射后γ-H2AX是否能反应体内各组织的DSB形成和修复的状况,从而为预测临床放射敏感性提供精确和可靠的指标;以及体内不同组织其放射敏感性差别的存在是否与DSB修复在差异有关。方法:照射诱导DSB形成试验,C57BL/6鼠行0.1 Gy,0.5 Gy和1.0 Gy全身照射后10分钟,收集正常组织（脑,肺,小肠和心脏）进行分析;DSB修复试验,修复正常鼠（C57BL/6）和修复缺陷鼠（BALB/c,A-T和SCID小鼠）在全身照射2Gy后0.5,2.5,5,24和48 h分析正常组织（脑,肺,小肠和心脏）。未照射的各系小鼠作为对照组。γ-H2AX免疫荧光染色和免疫组化染色分析正常组织（脑,肺,小肠和心脏）中的DSB形成和修复的指标。结果:DSB形成试验,在对照组我们仅见到很少数目的γ-H2AX焦点,而受照射后γ-H2AX焦点数目明显增加,并显示出明显的剂量相关。在不同DSB修复能力的鼠系分析其修复的状态,我们发现正常修复功能的C57BL/6,γ-H2AX焦点随时间的延长迅速减少,在照射后24和48小时仅有很低水平DSB未修复;而SCID鼠在放射治疗后所有的时间点都显示出γ-H2AX焦点的明显增加,A-T小鼠表现出较低的修复缺陷,主要表现在较晚的时间点（≥5h）γ-H2AX焦点的中度增加;放射敏感的BALB/C鼠表现出与C57BL/6相比轻度增加的γ-H2AX焦点数量。同时发现不同放射反应的组织的DSB修复动力学过程表现相似。结论:本研究表明γ-H2AX焦点分析可以作为一项精确的指标,在体内衡量临床相关剂量电离辐射诱导的DSB形成和修复,因此γ-H2AX分析可以作为预测临床放射敏感性提供精确和可靠的指标;体内不同的组织在DSB形成和修复动力学表现上是一致的,虽然其放射敏感性有显著不同,考虑与其下游途径:微环境的改变,凋亡的产生等有关。第一部分电离辐射后小鼠神经元细胞与小胶质细胞DSB修复的差异目的:DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤形式,临床剂量放射治疗后,不同的组织显示出不同的放射反应,可能与其内在的放射敏感性相关,而关于脑组织中不同的细胞类型DSB修复的差异研究少见。已经证实γ-H2AX焦点可以作为体内分析DSB形成和修复的指标,本研究以γ-H2AX焦点为观察DSB修复的指标,研究临床剂量的电离辐射后小鼠神经元细胞和小胶质细胞DNA双链的断裂及修复,探讨二者是否存在差异以及与此相关的内在功能性的变化。方法:电离辐射诱导DSB形成试验,C57BL/6鼠行0.1,0.5和1.0Gy全身照射后10min,收集脑组织进行分析;DSB修复试验,修复功能正常鼠（C57BL/6）在全身照射2Gy后0.5,2.5,5,24和48 h收集脑组织进行分析。未照射的各系小鼠作为对照组。γ-H2AX和NeuN,Iba-1免疫荧光双重染色和免疫组化染色分析脑组织神经元和小胶质细胞DSB修复和小胶质细胞的形态学变化。结果:DSB形成试验,在对照组脑组织神经元和小胶质细胞的细胞核,仅有数目很少的γ-H2AX焦点,而受照射后细胞核内γ-H2AX焦点数目显著增加,并显示出明显的剂量相关。通过分析不同放射敏感性的小鼠电离辐射后脑组织神经元和小胶质细胞的DSB修复动力学,他们二者的γ-H2AX焦点消失情况一致,同时发现伴有小胶质细胞的形态学激活。结论:临床剂量的放射治疗后脑组织中小胶质细胞和神经元的DSB形成和修复动力学是相似的。令人惊奇的是同时发现有小胶质细胞的激活,可能伴有功能的变化。激活的小胶质细胞参与触发和扩大脑组织的炎症反应,如果我们可以发现可以激活小胶质细胞而神经元可以耐受的剂量,这将会对一些疾病的治疗产生影响,例如:放射性脑损伤,帕金森病的治疗。第三部分电离辐射诱导小胶质细胞激活目的:前期研究提示在临床剂量的照射后,小胶质细胞可以在体内激活,并可能伴随有功能的变化。本研究主要观察放射能否在体外引起小胶质细胞激活及其可能的信号传导通路。方法:在接受16Gy照射后3,6,12,24和48 h收集小胶质细胞进行分析,观察细胞形态学的改变;采用Western Blot检测不同时间点NF-κB的P65蛋白的表达。结果:在接受照射后,小胶质细胞发生伴有激活状态的形态学变化,表现为变为较圆的外表,胞体表面的突起发生紧缩、消失;同时发现P65蛋白的表达上调。这些结果说明电离辐射后小胶质细胞可以激活。结论:放射可以在体外引起小胶质细胞激活,可能是通过NF-κB的信号通路,激活的小胶质细胞将对一些疾病的治疗产生影响,例如:放射性脑损伤,帕金森病的治疗。