口蹄疫病毒免疫原基因在番茄和拟南芥中的表达及转基因番茄动物免疫试验

论文题目: 口蹄疫病毒免疫原基因在番茄和拟南芥中的表达及转基因番茄动物免疫试验

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 潘丽

导师: 谢庆阁,张永光

关键词: 口蹄疫病毒,转基因疫苗,免疫原性,豚鼠

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 口蹄疫是当今世界上危害最严重的家畜传染病之一。疫苗接种是预防口蹄疫的主要措施。近年来,随着植物基因工程的发展,用转基因植物表达抗原相对于传统疫苗而言是一种更安全、更经济的表达系统。本研究将口蹄疫病毒免疫原基因整合进番茄基因组并得以表达,用转基因番茄叶片蛋白提取液经肌肉途径免疫豚鼠,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行植物疫苗免疫原性的研究,为FMD转基因疫苗的开发奠定基础。 此外,由于植物种子生产外源基因工程蛋白质的品质相当稳定,可作为饲料添加剂或口服疫苗,为优化表达体系,本研究构建了FMDV结构蛋白VP1基因的种子特异性表达载体。具体结果如下: 1)构建了O型FMDV China99株结构蛋白VP1基因的组成型植物双元表达载体pBin438/VP1及结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B基因的组成型植物双元表达载体pBin438/P12X3C。VP1基因及起始密码ATG、内质网引导多肽SEKDEL共660个核苷酸,编码220个氨基酸;P12X3C基因及起始密码ATG、内质网引导多肽SEKDEL共3018个核苷酸,编码1006个氨基酸,与亲本毒株相应核苷酸序列比较,同源性分别为100%和99.6%。 2)建立了番茄高频转化系统。高频转化系统以MS为基本培养基,附加ZT1.0mg/L和IAA0.1mg/L,选8～10日苗龄的子叶预培养2d,在活化的根癌农杆菌菌液里侵染3～5min,于暗处共培养2d后,直接在含卡那霉素再生培养基上筛选培养,形成抗性愈伤并分化出芽。转化率达18%。 3)转基因番茄PCR检测表明:FMDV免疫原基因VP1和P12X3C分别整合到番茄基因组中;RT-PCR结果证实目的基因在转基因番茄的转录水平表达;ELISA检测约40%的pBin438/VP1卡那抗性植株呈阳性,约25%的pBin438/P12X3C卡那抗性植株阳性:随机选取部分ELISA检测阳性植株进行Western blotting检测,重组蛋白能够与FMDV抗血清反应。表明FMDV免疫原基因VP1和P12X3C已分别转入番茄基因组并获得表达,且所表达的蛋白具有免疫反应性。 4)构建了FMDV结构蛋白VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,浸花法转化拟南芥,分子检测表明,VP1基因已整合进拟南芥基因组并在荚中获得表达,为今后将FMDV免疫基因转入大豆等油料植物种子提供了实验依据。 5)转基因番茄叶片蛋白提取液免疫豚鼠,第一次免疫后10d ELISA检测不到FMD特异性抗体,第二次免疫后10d,豚鼠血清抗体水平显著提高并达到第一个高峰,第三次免疫后21d,抗体水平达到第二个高峰,其中pBin438/VP1转基因番茄第三次免疫豚鼠后21天血清效价最高可达1:64,攻毒后免疫豚鼠保护率达80%,pBin438/P12X3C转基因番茄第三次免疫后21天血清效价最高可达1:128,攻毒后免疫豚鼠保护率达100%。

论文目录:

第一章 序言

1.1 研究背景

1.1.1 口蹄疫与口蹄疫病毒

1.1.2 口蹄疫疫苗的研究概况

1.2 转基因植物疫苗的原理和策略

1.2.1 植物基因转化载体系统的构建

1.2.2 转基因植物疫苗表达系统

1.3 转基因可饲(食)疫苗的免疫机理

1.4 转基因疫苗国内外研究现状

1.4.1 大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LT-B)在植物中的表达

1.4.2 乙肝表面抗原(HBsAg)在植物中的表达

1.4.3 诺沃克病毒衣壳蛋白(NVCP)在植物中的表达

1.4.4 猪传染性胃肠炎病毒S糖蛋白(TGEV-S)在植物中的表达

1.4.5 口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1在植物中的表达

1.4.6 狂犬病病毒糖蛋白(G蛋白)在植物中的表达

1.5 转基因疫苗存在的问题及未来研究的展望

1.5.1 外源基因在植物中表达量低

1.5.2 如何建立高频再生的遗传转化受体系统是制约研究者开发有应用前景的可饲疫苗的“瓶颈”

1.5.3 转基因植物疫苗的免疫原性问题

1.5.4 转基因疫苗可能引起免疫耐受

1.6 本研究的目的及意义

第二章 口蹄疫病毒O／China／99株植物双元表达载体的构建

2.1 材料和方法

2.1.1 质粒和菌株

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 FMDV VP1基因植物双元表达载体pBin438／VP1的构建

2.1.5 FMDV多基因植物双元表达载体pBin438／P12X3C的构建

2.2 结果与分析

2.2.1 植物表达Mini-Ti质粒pBin438／VP1的构建及序列分析

2.2.2 FMDV VP1基因植物双元表达载体的构建

2.2.3 植物表达Mini-Ti质粒pBin438／P12X3C的构建及序列分析

2.2.4 FMDV多基因植物双元表达载体的构建

2.3 讨论

第三章 口蹄疫病毒免疫原基因在番茄中的转化

3.1 材料和方法

3.1.1 植物材料

3.1.2 转化载体

3.1.3 试剂的配制

3.1.4 种子的准备和消毒方法的确定

3.1.5 番茄的再生

3.1.6 不同植物激素浓度对番茄子叶再生的影响

3.1.7 Kan梯度预实验

3.1.8 番茄子叶的遗传转化

3.2 结果与分析

3.2.1 种子消毒方法的确定

3.2.2 番茄的转化与再生系统

3.2.3 转基因番茄卡那霉素抗性植株的获得

3.3 讨论

3.3.1 植物细胞的全能性与高效再生转化系统的建立

3.3.2 培养基中不同激素配比对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响

3.3.3 转化细胞的选择

3.3.4 预培养对转化率的影响

第四章 口蹄疫病毒免疫原基因在番茄中的整合与表达

4.1 材料与方法

4.1.1 植物材料

4.1.2 主要试剂及仪器

4.1.3 PCR法检测外源基因的整合

4.1.4 转基因番茄的RT-PCR检测

4.1.5 转基因番茄表达蛋白的双抗夹心ELISA检测

4.1.6 转基因番茄表达蛋白的Western-blotting检测

4.2 结果

4.2.1 转基因番茄的PCR检测

4.2.2 转基因番茄的RT-PCR检测

4.2.3 目的基因在番茄中表达蛋白的ELISA检测

4.2.4 目的基因表达蛋白的Western-blotting检测

4.3 讨论

4.3.1 外源基因在植物中的整合

4.3.2 外源基因在转基因植物中表达

4.3.3 外源基因在植物中表达存在的问题

4.3.4 未来研究的方向

第五章 口蹄疫病毒VP1基因在转基因拟南芥种子中的表达及活性检测

5.1 材料与方法

5.1.1 质粒和菌株

5.1.2 试剂及植物材料

5.1.3 引物的设计与合成

5.1.4 种子特异性表达Mini-Ti质粒p7SBin438／VP1的构建

5.1.5 FMDV种子特异性双元表达载体的构建

5.1.6 浸花法(Floral dip)转化拟南芥

5.1.7 拟南芥TO代种子的抗性筛选

5.1.8 转基因拟南芥的PCR检测

5.1.9 转基因拟南芥Western-blotting检测

5.2 结果

5.2.1 种子特异性表达Mini-Ti质粒p7SBin438／VP1的构建

5.2.2 植物种子特异性双元表达载体的构建

5.2.3 拟南芥种子的收获和抗性筛选

5.2.4 转基因拟南芥的PCR检测

5.2.5 转基因拟南芥的Western-blotting分析

5.3 讨论

第六章 转基因番茄的动物免疫试验

6.1 材料和方法

6.1.1 植物材料和实验动物

6.1.2 主要试剂

6.1.3 疫苗的制备及免疫剂量

6.1.4 实验动物免疫

6.1.5 抗体的监测

6.1.6 攻毒试验

6.2 结果

6.2.1 豚鼠体内FMDV特异性抗体的动态变化

6.2.2 转基因疫苗免疫豚鼠的抗体滴度

6.2.3 攻毒试验

6.3 讨论

6.4 转基因疫苗的应用前景及未来研究的方向

第七章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历

发布时间: 2005-09-05

参考文献

• [1].HAL1和merB基因增强转基因植物耐盐和抗汞能力研究[D]. 田吉林.浙江大学2003
• [2].番茄SlAV2基因的克隆、表达和功能分析[D]. 孟夏.山东农业大学2015
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• [4].番茄SpWRKY转录因子基因的克隆及功能分析[D]. 李景滨.大连理工大学2015
• [5].类受体激酶SOBIR1互作蛋白的鉴定及功能分析[D]. 毕国志.东北农业大学2015

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