大黄蒽醌衍生物对大鼠结肠及LoVo细胞水通道蛋白表达的调节效应与其机制研究

论文摘要

大黄以其显著的“泻下”效用而著称,临床应用广泛。大黄发挥泻下的活性物质为大黄蒽醌衍生物,而其中大黄素、大黄酸为主要的游离型大黄蒽醌衍生物。既往研究证实,大黄能够抑制结肠肠腔水分的吸收,增加肠腔内水含量而致泻。水通道蛋白（aquaporin, AQPs）是近年来发现的主要负责水分子转运的一类膜蛋白质家族,其中已确定水通道蛋白2（aquaporin2, AQP2）和水通道蛋白4（aquaporin4, AQP4）在结肠表达,并且对结肠内水分的吸收起着重要作用。那么,大黄蒽醌衍生物是否通过调节结肠上皮细胞（colonic epithelial cells, CEC）AQP2和AQP4的表达而影响结肠内水分的吸收,从而起泻下作用呢,目前尚无研究探讨。我们首先观察了大黄总蒽醌对大鼠的泻下效应及其对大鼠结肠AQP4的调节效应。而后,我们以来源于结肠腺癌的细胞系LoVo细胞为靶细胞,采用免疫细胞化学（immuocytochemistry, ICC）的方法探讨了AQP2和AQP4在LoVo细胞的表达,并进一步采用western blot（WB）和RT-PCR等方法,观察了大黄酸、大黄素对体外培养LoVo细胞AQP2和AQP4表达的调节效应。最后,我们通过观察蛋白激酶A（protein kinase, PKA）在大黄素下调LoVo细胞AQP4过程中的作用机制,探讨大黄素下调LoVo细胞AQP4的细胞信号传导通路。现报告如下。实验一:大黄蒽醌衍生物对大鼠结肠APQ4表达的调节效应目的探讨大黄总蒽醌对SD大鼠的泻下效应及对其结肠AQP4表达的影响。方法雄性SD大鼠24只随机分为正常对照组、大黄总蒽醌泻下剂量组及大黄总蒽醌高剂量组,分别予大黄总蒽醌悬液或蒸馏水灌胃5 d后,观察大鼠结肠粪便含水量的变化;应用WB、RT-PCR观察其近端结肠AQP4表达的变化。结果大黄总蒽醌泻下剂量组及高剂量组灌胃5 d后,大鼠结肠内粪便含水量显著增加,同时其近端结肠AQP4表达显著降低且表现为量效关系。实验二:大黄素、大黄酸对LoVo细胞AQP4表达的调节效应目的探讨大黄酸、大黄素对体外培养LoVo细胞AQP4的调节效应。方法体外培养LoVo细胞并予不同质量浓度大黄酸或大黄素含药培养液24 h作用及大黄酸或大黄素含药培养液（20 mg/L）不同时间作用。采用ICC法观察LoVo细胞AQP4蛋白表达定位,采用WB及RT-PCR检测AQP4蛋白及mRNA的表达。结果AQP4蛋白主要表达在LoVo细胞的细胞膜上,在细胞浆也有少量表达;大黄酸及大黄素能够显著下调体外培养LoVo细胞的AQP4蛋白及mRNA表达,且表现为剂量-效应及时间-效应关系。实验三:大黄素、大黄酸对LoVo细胞AQP2表达的调节效应目的探讨大黄酸、大黄素对体外培养LoVo细胞AQP2的调节效应。方法体外培养LoVo细胞并予不同质量浓度大黄酸或大黄素含药培养液24 h处理及大黄酸或大黄素含药培养液（20 mg/L）不同时间处理。其中不同质量浓度分为高剂量组（大黄酸或大黄素40 mg/L）、中剂量组（大黄酸或大黄素20 mg/L）、低剂量组（大黄酸/大黄素10 mg/L）、正常对照组;不同作用时间分为0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h组。采用ICC法观察LoVo细胞AQP2蛋白表达定位,采用WB及RT-PCR检测AQP2蛋白及mRNA的表达。结果AQP2主要表达于LoVo细胞的细胞膜上。大黄素、大黄酸均可抑制LoVo细胞AQP2的表达。剂量-效应方面,随着大黄素或大黄酸作用质量浓度的增加,LoVo细胞AQP2蛋白及mRNA均进行性下降:其中与对照组比较,AQP2蛋白在中剂量组及高剂组显著降低（P<0.05; P<0.01）;AQP2 mRNA中剂量组及高剂组显著降低（大黄酸中剂量组P<0.05,余为P<0.01）。在时间效应方面,大黄酸48 h作用组LoVo细胞AQP2蛋白及mRNA表达极低而未测值;AQP2蛋白在大黄素、大黄酸作用3 h及6 h组表达上升但无统计学意义,但在其它时间组均表达下降（大黄素作用12 h,24 h,48 h组,P<0.01;大黄酸作用24 h组,P<0.05）。AQP2 mRNA在大黄素作用各时间组均显著性下降（P<0.01）,而在大黄酸作用12 h、24 h组也显著性下降（P<0.05; P<0.01）。实验四:大黄素通过PKA途径对LoVo细胞AQP4的调节目的通过观察LoVo细胞蛋白激酶A（PKA）活性变化,探讨大黄素下调LoVo细胞AQP4的细胞信号传导通路。方法体外培养LoVo细胞并予大黄素含药培养（20 mg/L）,8-Bromo-cAMP含药培养液液（100μmol/L）,大黄素（20 mg/L）及8-Bromo-cAMP（100μmol/L）含药培养液,不含药培养液等作用24 h,采用WB检测各组AQP4蛋白的表达,采用非放射性PKA活性检测试剂盒检测各组PKA活性水平。结果PKA激动剂8-Bromo-cAMP使LoVo细胞PKA活性水平及AQP4表达水平显著升高;而大黄素对LoVo细胞PKA活性及AQP4表达的调节则显示为与8-Bromo-cAMP相反的结果。8-Bromo-cAMP与大黄素共同作用于LoVo细胞时,8-Bromo-cAMP能够对抗大黄素对LoVo细胞PKA活性及AQP4表达的下调效应。结论:1.大黄总蒽醌能够有效抑制大鼠结肠AQP4的表达,使其结肠内水含量增加,从而起到泻下作用;2. AQP2及AQP4均表达于LoVo细胞,LoVo细胞可以作为研究药物对AQP2和AQP4调节效应的靶细胞;大黄素、大黄酸可以有效抑制LoVo细胞AQP2和AQP4的基因转录与翻译;由此推断,大黄素、大黄酸通过抑制CEC AQP2和AQP4的表达,使结肠内水含量增加从而发挥泻下效应;3. PKA参与了大黄素对LoVo细胞AQP4的下调作用,提示大黄素可能通过调节PKA这一细胞信号传导分子的活性从而下调LoVo细胞AQP4表达;4.本研究阐明了大黄蒽醌衍生物对CEC及LoVo细胞的调节效应并探讨了可能的细胞传导信号;为从AQPs的角度探讨大黄蒽醌衍生物的泻下药理机制提供了新的视野。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 一 大黄泻下机制的研究进展
• 二 AQP2 及AQP4 在结肠的表达及调节
• 1 AQP2 的结构与在结肠的表达
• 2 AQP2 在结肠表达与活性的调节
• 3 AQP4 的结构与在结肠的表达
• 4 AQP4 在结肠表达与活性的调节
• 三 中医药对水通道蛋白调节效应研究进展
• 四 大黄泻下与水通道蛋白的关系探讨
• 正文
• 实验一 大黄蒽醌衍生物对大鼠结肠AQP4 表达的调节效应
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 大黄总蒽醌的给药剂量及给药方法
• 2.2 取材
• 2.3 粪便含水量测定
• 2.4 WB检测
• 2.5 RT-PCR检测
• 2.6 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 一般情况观察
• 3.2 大黄总蒽醌对粪便含水量的影响
• 3.3 大黄总蒽醌对SD大鼠近端结肠AQP4 蛋白及mRNA 表达的调节效应
• 4 讨论
• 4.1 大黄泻下效应与结肠AQP4 表达的关系探讨
• 4.2 大黄总蒽醌的泻下效应与对近端结肠AQP4 的调节
• 4.3 实验小结
• 实验二 大黄素、大黄酸对LoVo细胞AQP4 表达的调节效应
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 LoVo细胞的培养
• 2.2 细胞爬片的制备
• 2.3 药物处理
• 2.4 ICC检测
• 2.5 WB检测
• 2.6 总RNA的提取及RT-PCR检测
• 2.7 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 AQP4 蛋白在LoVo细胞的表达
• 3.2 大黄酸、大黄素对LoVo细胞AQP4 蛋白及mRNA表达的调节效应
• 4 讨论
• 4.1 LoVo细胞AQP4 的表达
• 4.2 大黄酸、大黄素泻下效应与对LoVo细胞AQP4 的调节
• 4.3 实验小结
• 实验三 大黄素、大黄酸对LoVo细胞AQP2 表达的调节效应
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 LoVo细胞的培养
• 2.2 细胞爬片的制备
• 2.3 药物处理
• 2.4 ICC检测
• 2.5 WB检测
• 2.6 总RNA的提取及RT-PCR检测
• 2.7 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 AQP2 蛋白在LoVo细胞的表达
• 3.2 大黄素对LoVo细胞AQP2 的调节效应
• 3.3 大黄酸对LoVo细胞AQP2 的调节效应
• 4 讨论
• 4.1 大黄酸、大黄素泻下效应与AQP2 在结肠的表达的关系探讨
• 4.2 LoVo细胞AQP2 的表达
• 4.3 大黄酸、大黄素泻下效应与对LoVo细胞AQP2 的调节
• 4.4 实验小结
• 实验四 大黄素通过PKA途径对LoVo细胞AQP4 的调节
• 0 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 细胞的培养及药物处理
• 2.2 PKA活性水平检测
• 2.3 WB检测
• 2.4 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 大黄素及8-bromo-cAMP对LoVo细胞的PKA活性的调节
• 3.2 大黄素及8-bromo-cAMP对LoVo细胞的AQP4 蛋白表达的调节
• 4 讨论
• 4.1 AQP4 的调节机制
• 4.2 大黄素通过PKA途径下调LoVo细胞AQP4 的表达
• 4.3 实验小结
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢