论文摘要
高等植物中普遍存在的生长素吲哚乙酸（IAA）,对植物的生长发育（如植株形态、器官分化、种子形成等）起着重要的调节作用。生长素结合蛋白（auxin-bindingprotein,ABP）是生长素调节过程中信号传导的先驱,它与生长素一起调节植物的生长发育过程,在细胞中的含量水平既关系到细胞的相对生长,又直接影响细胞对生长素的敏感性。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,也是重要的模式植物之一,深入研究水稻ABP基因的功能及其调控方式并获得突变材料将为水稻遗传改良打下坚实基础。本研究以粳稻日本晴幼苗的RNA为材料,用RACE及重组PCR技术克隆ABP全长cDNA,并对其序列进行了生物信息学分析和预测。同时,利用获得的ABP进行了原核表达载体构建及RNA沉默载体构建、表达研究等,为获得水稻产量、品质和抗性方面的突变材料作了一些探索性的工作。主要研究结果如下:1、克隆了水稻ABP全长cDNA,测序结果已登录到GenBank,登录号为EU595028。该cDNA全长920 bp（polyA除外）编码206个氨基酸。含有GAGA转录顺式作用元件、核糖体结合位点（RBS）、polyA加尾信号、糖皮质激素作用位点等转录因子作用位点。序列分析显示所得核苷酸序列与玉米生长素结合蛋白基因（zm-ABP1）的核苷酸序列同源性达79%,氨基酸序列同源性达78%,同样具有3个氨基酸保守结构域,C端内质网识别信号KDEL和1个糖基化位点（NSTF）,表明此基因在不同物种间保守性较高。跨膜预测分析显示,水稻ABP在1-44号氨基酸信号肽部分存在跨膜区。因此,推测水稻ABP可能是一种大量存在于内质网的分泌型蛋白,且位于质膜进行信号传导时与其它蛋白锚定。二级结构与三级结构预测显示,其功能结构域主要集中于β-片层结构区域,该区域与ABP的生物学功能关系密切,预测综合分析显示可形成有效结合生长素的区域。2、分别构建包含水稻ABP全长cDNA和编码框的原核表达载体,以大肠杆菌BL21（DE3）pLysS为蛋白表达系统尝试进行了GST融合表达,以获得纯化的水稻ABP进行生化、免疫和蛋白质相互作用方面的研究。但经诱导时间和诱导剂浓度梯度多次筛选,并未观察到与阴性对照有差异条带,因此可初步认为水稻ABP表达的条件特殊,不能在此原核表达系统中有效表达或者水稻ABP对大肠杆菌的生长不利导致不能有效表达。3、为了能用外界诱导因素调控植物体内的RNA沉默,用来自拟南芥的HSP18.2热激启动子构建热激诱导型真核表达载体pCAMBIA1301-HSP,并通过GUS基因的表达证明此表达载体能在热激条件下有效表达水稻愈伤组织中的外源基因。根据水稻ABP cDNA序列和水稻基因组序列的比对结果,确定了水稻ABP基因的外显子和内含子的位置关系,通过引物设计和重组PCR方法得到以水稻ABP基因内含子为茎环结构,外显子为反向互补序列的DNA发夹结构片段。在此基础上构建了热激诱导型的RNA沉默载体pCAMBIA1301-HSP-ABP并转化水稻愈伤组织以获得水稻ABP基因诱导型缺陷突变材料。转化后的材料死亡,推测存在可能因ABP缺损导致了细胞生长停止或致死。因此,下一步的研究可在表达载体上插入阻遏蛋白基因,提高诱导型载体的严谨性。